柑橘绿霉菌的遗传转化和抑霉唑抗性分子机制研究

【摘要】： 柑橘绿霉菌(Penicillium digitatum)是引起贮藏期柑橘腐烂最重要的一种病原。本研究首次建立了根癌农杆菌介导的柑橘绿霉菌遗传转化体系,转化效率达十万分之一,所获的突变体多为随机单拷贝插入突变。该体系的建立有助于柑橘绿霉菌基因功能研究的开展。 在评价柑橘绿霉菌对抑霉唑的抗性及其抗性分子机制时,发现一种抗性机制尚未报道的抑霉唑抗性菌系。比较7个抑霉唑敏感菌株和14个抑霉唑抗性菌株的甾醇-14α-脱甲基酶基因(PdCYP51,抑霉唑的靶标基因)编码区的氨基酸序列和PdcYP51基因上游启动子区的核苷酸序列,均未发现与抗性相关的点突变。本研究从建立的柑橘绿霉菌的EST库中搜索另两个个CYP51基因,称之为PdCYP5 1B和PdCYP51C。实时荧光定量PCR分析表明,2个抑霉唑敏感和7个未知抑霉唑抗性菌株间3个CYP51基因(PdCYP51.PdCYP51B和PdCYP51C)的本底表达水平无显著性差异。由此推断未知抗性机制的抑霉唑与PdCYP51编码区和上游启动子区的突变无关,也与这3个CYP51基因的表达水平无关。 本研究克隆了柑橘绿霉菌的一个促扩散超家族基因PdMfs1。该基因含有一个1,876 bp的开放阅读框(ORF),含有3个大小分别为55 bp,49 bp和71 bp的内含子,编码566个氨基酸,与MFS运输蛋白中的DHA14家族蛋白高度同源。表达分析表明PdMfs1的表达与抑霉唑抗性水平呈正相关,但表达水平间的差异远低于抗性水平间的差异。抑霉唑等杀菌剂均能诱导抑霉唑抗性和敏感菌株的PdMfs1基因表达上升。PdMfs1基因在酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)中异源表达能显著提高酵母菌对DMIs类杀菌剂及其他不相关毒性化合物的抗性。进一步的研究发现,将PdMfs1基因功能缺失能显著地降低柑橘绿霉菌对抑霉唑的抗性,但未能降低到与敏感菌株可比的水平；将PdMfs1基因重新插入到PdMfs1缺失突变体(ΔPdMfs1)中,能恢复该缺失菌株对抑霉唑等药物抗性；过表达PdMfs1基因能提高菌体对这些药物抗性。综合这些结果,可认为柑橘绿霉菌的PdMfs1基因参与了柑橘绿霉菌对抑霉唑等DMIs杀菌剂和其他毒性物质的部分抗性,但并不是作者发现的未知机制菌系的抑霉唑抗性关键机制。 比较PdMfsl缺失、互补、过表达突变体,以及野生型菌株对柑橘果实的致病性差异,发现缺失突变体的致病性显著低于野生菌株,而该基因回补可恢复其致病性,由此说明PdMfsl参与了柑橘绿霉菌的致病过程。