锌对大鼠肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD-1）的影响及其调控机理研究

【摘要】： 锌是动物必需微量元素之一,具有重要的生理功能和营养作用。生物体缺锌与必需脂肪酸缺乏表现出相似的临床症状,而且缺锌加剧必需脂肪酸缺乏症状,说明锌在脂肪酸代谢中起着重要的调节作用,但目前其分子机理尚未阐明。本文系统研究了日粮缺锌与高锌对SD大鼠生长发育及肝脏基因表达谱的影响,发现日粮锌可影响硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase-1, SCD-1)及其转录调控因子的基因表达；并进一步通过短期锌注射试验,检测了血清脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、血浆激素、肝脏和血浆脂肪酸组成、SCD-1及其相关转录调控因子的mRNA水平,探讨了锌对硬脂酰去辅酶A去饱和酶的转录调控机理；利用原代肝细胞培养技术,明确了锌对SCD-1的转录调控途径。主要研究内容和结果如下： 1.锌对SD大鼠生长性能与体内锌水平的影响 选用体重为90±5 g雄性SD大鼠100只,经3天适应性喂养后随机分为4组,分别为缺锌组(zinc deficiency, ZD,3.20mg/kg)、配饲组(paired-fed, PF,对照组Ⅰ)、正常锌组(zinc adequacy, ZA,46.39 mg/kg,对照组Ⅱ)和高锌组(zinc overdose, ZO,234.39 mg/kg)。每组25只大鼠,分笼饲养,每笼5只,于屏障系统中饲养5周,每天记录采食量(每笼),每周称重(单只)一次。饲养结束后,屠宰并解剖取样分析。结果表明,①饲喂缺锌日粮的大鼠表现出典型的缺锌症状,即精神萎靡、活动量减少、食欲不振、毛发紊乱无光泽、角质化严重甚至脱毛等症状,与配饲组相比体格明显瘦小；而饲喂高锌日粮的大鼠精神状况良好,采食行为正常,毛发柔顺光亮,且个体大于正常组。②与PF组相比,ZD组大鼠的体重、器官重量、体内锌水平和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatate.ALP)活性均显著(P0.05)降低；与ZA组相比,ZO组大鼠的体重、器官重量、锌水平和ALP活性均显著(P0.05)增加。 2.锌对肝脏基因表达谱的影响 采用表达谱基因芯片技术,发现了缺锌和高锌均能影响SD大鼠肝脏基因表达谱。对芯片中差异表达基因进行聚类分析表明,缺锌组中有68个基因的表达水平发生了显著变化,高锌组有76个基因发生了显著差异表达。这些差异表达基因的产物参与机体脂肪代谢、氮代谢、碳水化合物代谢、离子转运、DNA转录与翻译、免疫和信号转导等功能。进一步筛选发现,低锌使SCD-1 mRNA水平显著降低,而高锌并未使之发生显著改变；缺锌使过氧化物酶体活化受体α(peroxisome proliferator activated receptor a, PPARa)和甲状腺激素受体(thyroid receptorβ, TRβ) mRNA水平显著下调,而高锌使二者mRNA水平均上调。 3.锌调控脂肪酸组成和SCD-1转录的机理 以注射氯化锂作为不良反应的阳性对照,研究了SD大鼠对腹腔注射锌的适应性反应,确定了不会引起动物产生不良反应的注射剂量,从而排除了因不良反应而影响机体正常生理功能的可能性。通过饲喂缺锌(3.30 mg／kg)和正常锌(38.89 mg／kg)日粮建立了两种内源锌水平不同的大鼠模型。在此基础上,试验设2个因子,其中因子A为注射锌：设4个水平,其单位活体重注射浓度分别为0、0.5、1.0和2.0μg/g,分别以A(0)、A(0.5)、A(1.0)和A(2.0)表示；因子B为大鼠模型,分别为大鼠体内正常锌和缺锌2个水平,分别以ZA和ZD表示。试验共计8个处理,每个处理设5个重复。研究了注射锌和内源锌对SD大鼠血清脂蛋白、总胆固醇、血糖、血浆激素、肝脏与血浆脂肪酸组成、SCD-1及其转录调控因子基因表达的影响,并分析了各个指标之间的相关性。主要结果如下： 3.1大鼠对腹腔注射锌的适应性反应 与纯净水消耗量相比,注射LiCl (150μg/g)组的大鼠对0.1%糖精水消耗量显著减少(P0.05),显示出不良反应：注射Zn (1.0μg/g)和Zn (2.0μg/g)组的大鼠对0.1%糖精水的消耗量与注射生理盐水组差异均不显著(P0.05),而注射Zn(3.0μg/g)组大鼠出现严重的不适反应甚至死亡,这表明注射剂量为2.0μg/g及以下水平的Zn均不会使大鼠产生不良反应。 3.2缺锌和正常锌大鼠模型的建立 饲喂缺锌日粮的大鼠表现出缺锌的典型症状。缺锌组的血清、肝脏、股骨和骨骼肌锌水平较正常锌组分别降低27.43%、15.39%、31.15%和27.30%(P0.05)。正常组大鼠毛发有光泽、采食和其他行为能力都正常。结果表明,已成功构建了缺锌和正常锌两种内源锌水平不同的大鼠模型。 3.3注射锌(A因子)的效应：以A(0)组为对照组 (1)锌对血清脂蛋白、总胆固醇和血糖等指标的影响：注射锌使ZA模型大鼠高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)和总胆固醇(total cholesterol, TC)与ZD模型中的葡萄糖(glucose, Glu)水平均显著提高(P0.05),而使肝脏游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平明显降低(P0.05)；注射剂量为2.0μg/g时,ZA模型中低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)和血糖与ZD模型中甘油三酯(triglyceride,TG)浓度均显著提高(P0.05)。 (2)锌对血浆激素的影响： 在ZA模型下,注射锌使血浆胰岛素(immunoreactive insulin, IRI)和胰高血糖素(pancreatic glucagon, PG)水平显著上升(P0.05),而使T4和leptin水平显著降低(P0.05)；在ZD模型中,腹腔注射锌增加IRI、T3、T4和leptin水平(P0.05),但减少PG水平(P0.05)。 (3)锌对肝脏脂肪酸组成的影响： 在ZA模型中,A(0.5)组的C16：0与C18：1含量和C18：1／C18：0比值显著降低(P0.05), C16:1含量和C16:1/C16:0比值则显著升高(P0.05); A(1)和A(2)中C16:0、C16:1、C18:0含量和C16:1/C16:0比值均显著提高(P0.05),而C18：1含量和C18:1/C18:0比值则显著降低(P0.05)。在ZD模型中,A(0.5)和A(1)组的C16:0、C16:1和C18：0含量均显著升高(P0.05), C18:1含量和C18:1/C18:0比值则显著降低(P0.05); A(2)中C18：0和C18：1含量与C18:1/C18:0比值都显著降低(P0.05)。 (4)锌对血浆脂肪酸组成的影响： 在ZA模型中,A(0.5)组的C16:0、C18:0与C18：1脂肪酸含量显著降低(P0.05),而C16:1/C16:0比值显著升高(P0.05)；A(1)和A(2)组中C16：0与C18：0脂肪酸含量均显著降低(P0.05), C16:1/C16:0和C18:1/C18:0比值则明显升高；此外,A(2)组的C16：1含量显著升高。在ZD模型中,除了C18：1／C18：0比值无明显变化外,A(0.5)组其他五个指标均显著降低(P0.05)；注射剂量为1.0μg/g使血浆脂肪酸组成(除C18：0含量不变之外)均显著降低(P0.05)：A(2)组中C16：1与C18：1含量和C16:1/C16:0与C18:1/C8:0比值均显著降低(P0.05),而C18：0脂肪酸含量则显著增加(P0.05)。 (5)锌对肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶及其调控因子mRNA水平的影响： 在ZA模型中,注射锌均可使肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶-1和固醇调节元件结合蛋白-1c (sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c) mRNA水平显著增加(P0.05)；同时,注射剂量为1.0和2.0μg／g还可使PPARa mRNA水平显著增加(P0.05),而TRp mRNA水平在注射剂量为0.5和2.0μg/g时也有显著增加(P0.05)。在ZD模型下,注射剂量为2.0μg／g均可使SCD-1 mRNA水平显著增加(P0.05)；注射剂量为1.0和2.0μg／g均可使PPARa和SREBP-1c mRNA水平显著增加(P0.05)；注射剂量为0.5μg／g使TRp mRNA水平显著降低(P0.05)。 3.4体内缺锌和正常锌模型效应： 以ZA组为对照组,内源缺锌使LDL、HDL、TG、TC、肝脏FFA、IRI、T3和T4水平均显著降低(P0.05),但对PG和leptin水平均无明显影响(P0.05)；同时,内源缺锌还显著降低肝脏中C16：1含量和C16:1/C16:0比值与血浆中C18：0和C18：1含量(P0.05),增加肝脏C18：1含量(P0.05)；缺锌大鼠中SCD-1和TRp mRNA水平均显著降低(P0.05)。 3.5相关性分析： (1)肝脏脂肪酸组成与生化指标之间的相关性分析： C16：0含量只与T3呈正相关(P0.05); C16:1含量分别与LDL、HDL、TC、PG、T3、IRI和Leptin呈正相关(P0.05); C16:1/C16:0比值与LDL、HDL、TC、TG、PG、T3、IRI和Leptin都呈正相关(P0.05); C18:0含量只与HDL呈正相关(P0.05); C18:1脂肪酸与LDL、HDL、TC、PG、IRI和Leptin均呈负相关(P0.05);C18:1/C18:0比值与LDL、HDL、TC和IRI呈负相关(P0.05)。 (2)肝脏脂肪酸组成与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析： SCD-1 mRNA水平与C16：1和C16:1/C16:0比值呈正相关(P0.05),而与C18：1和C18:1/C18:0比值呈负相关(P0.05); PPARa mRNA水平与肝脏脂肪酸组成均无相关性(P0.05); TRp与C16：0和C18：1含量呈负相关(P0.05),但是与C16:1/C16:0比值呈正相关(P0.05); SREBP-1c mRNA水平与C18：1和C18:1/C18:0比值呈负相关(P0.05),而与C16:1/C16:0比值呈正相关(P0.05)。 (3)血浆脂肪酸组成与生化指标之间的相关性分析：TG与C18：1呈负相关(P0.05),与C18:1/C18:0比值呈正相关(P0.05)；T3与C16:1/C16:0比值呈负相关(P0.05),与C18：0含量呈正相关(P0.05); T4与C16：1含、C16:1/C16:0和C18:1/C18:0比值呈负相关(P0.05),与C18：0含量呈正相关(P0.05)；IRI与C16:0、C18:0含量和C16:1/C16:0比值呈负相关(P0.05); leptin与C18：0含量呈正相关(P0.05),而与C18:1/C18:0比值呈负相关(P0.05)。 (4)血浆脂肪酸组成与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析： C16：1含量与肝脏SCD-1和SREBP-1c mRNA水平呈正相关(P0.05);C18:1含量与TRp mRNA水平呈负相关(P0.05); C18:1/C18:0比值与SCD-1和SREBP-1c mRNA水平呈负相关(P0.05)。 (5)激素与SCD-1及其调控因子表达水平之间的相关性分析： SCD-1 mRNA水平与PG. IRI、T3和T4呈正相关(P0.05); TRp mRNA水平与PG和T3呈正相关(P0.05)；SREBP-1c则只与IRI呈正相关(P0.05)。 4.锌调控原代肝细胞中SCD-1转录的机理 以缺锌大鼠的原代肝细胞为材料,发现400μM二乙烯三胺五乙酸(Diethylene triamine pentoacetic acid, DTPA)使SREBP-1c mRNA水平显著降低(P0.05),而PPARa mRNA水平明显上调(P0.05)；DTPA浓度为600μM时,SCD-1、TRp. SREBP-1c和PPARa mRNA水平均显著降低(P0.05)。以正常锌大鼠的原代肝细胞为材料,发现锌(培养液中浓度为10、50和100μM)均使SREBP-1c mRNA水平明显升高(P0.05)；除锌浓度为100μM组外,其他锌水平均使SCD-1和TRβmRNA水平显著升高(P0.05)；其中锌浓度为50μM时,SCD-1基因表达水平为最高。相关性分析发现,SCD-1 mRNA水平分别与TRβ和SREBP-1c转录丰度呈正相关(P0.05)。