提高木聚糖酶热稳定性、催化活性和结合水解纤维素能力的研究

【摘要】： 为了提高木聚糖酶的热稳定性、催化活性和底物的结合水解性能,本研究以G／11家族黑曲霉木聚糖酶A(Aspergillus niger xylanase A, AnxA)和褐色高温单孢菌木聚糖酶A(Thermomonospora fusca xylanase A, TfxA)为亲本,设计出两种杂合木聚糖酶基因,并系统研究了毕赤酵母表达的杂合木聚糖酶及其亲本酶的酶学性质。主要研究结果如下： 1杂合木聚糖酶基因atx的分子设计和表达 为了提高AnxA的热稳定性和催化活性,其催化结构域N-末端序列被TfxA中相应序列所取代,获得的杂合木聚糖酶基因atx在大肠杆菌中的表达产物EATx主要以包涵体形式存在。atx在毕赤酵母中获得表达,其表达产物PATx和AnxA具有相同的催化活性中心。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATx86发酵上清液中木聚糖酶PATx活性为633.0 U／mg,分别是酵母表达黑曲霉木聚糖酶A (reAnxA)和酵母表达褐色高温单孢木聚糖酶A (reTfxA)的3.6倍和5.4倍。因此,通过N-末端序列替换显著提高了AnxA的催化活性。进一步分析表明,IPATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。 2杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的酶学性质 PATx的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0；在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为72%；在pH3.0.9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reAnxA的最适温度和最适pH分别是50℃和pH5.0；在70℃、pH5.0条件下处理2 min,残余酶活为42%；在pH3.0-8.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。reTfxA的最适温度和最适pH分别是60℃和pH6.0；在70℃、pH6.0条件下处理2 min,残余酶活为70%；在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均在80%以上。SDS-PAGE结果表明,IPATx的相对分子量为20.78 kDa,与理论推算的分子量(21.04 kDa)相吻合。杂合木聚糖酶PATx具有较好的pH稳定性。通过与TfxA的N-末端序列替换显著提高了AnxA的热稳定性,表明reTfxA的N-末端序列与酶蛋白的热稳定性密切相关。 小麦木聚糖酶抑制剂TAXI-I对PATx、reAnxA和reTfxA均具有抑制活性。相同酶活的PATx、reAnxA和reTfxA分别与TAXI-I在20℃下作用30 min,其残余酶活分别为35.0%、18.0%和85.3%。表明,TfxA的N-末端序列替换提高了AnxA对小麦木聚糖酶抑制剂的抗性。 采用高效液相色谱(HPLC)法,对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物的分析表明,杂合木聚糖酶PATx水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木三糖；reAnxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物分别为木糖至木五糖、木糖至木六糖,其主要产物均为木三糖；而reTfxA水解桦木木聚糖和小麦麸皮不溶木聚糖产物均为木糖至木六糖,其主要产物均为木二糖。 以低聚木糖为底物对杂合木聚糖酶PATx及其亲本酶的水解模式研究表明,杂合木聚糖酶PATx为内切型木聚糖酶,其对木二糖和木三糖没有水解活性,能够水解木四糖、木五糖和木六糖,最小水解单元为木四糖；reAnxA和reTfxA均能水解木二糖至木六糖,二者最小水解单元均为木二糖；且PATx、reAnxA和reTfxA均具有转糖苷化活性。 3杂合木聚糖酶基因atxx的分子设计和表达 为了提高杂合木聚糖酶PATx对纤维素类底物的结合和水解能力,将TfxA的连接序列和木聚糖结合域(XBD)融合在PATx的C-末端,获得的杂合木聚糖酶基因atxx在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物为PATxX。经0.25%甲醇诱导培养96h,基因工程菌pPATxXl发酵上清液中PATxX的木聚糖酶活性和纤维素酶活性分别为452.1 U／mg和19.3 U／mg。 4杂合木聚糖酶PATxX的酶学性质 PATxX木聚糖酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH5.0,与杂合木聚糖酶PATx相同。PATxX在70℃、pH7.0下处理2 min,残余酶活为66%；在pH4.0-9.0,25℃下处理1h,残余酶活均不低于80%。PATxX木聚糖酶与小麦木聚糖酶抑制剂作用后其残余酶活为41.0%。 杂合木聚糖酶PATxX水解桦木木聚糖产物为木糖至木五糖,主要产物为木三糖；PATxX水解小麦麸皮不溶木聚糖产物为木糖至木六糖,主要产物为木六糖,其次为木二糖和木三糖。IPATxX为内切型木聚糖酶,对木二糖至木六糖均具有水解活性,最小水解单元为木二糖,并具有转糖苷化活性。 25℃,结合3h后,PATxX和reTfxA对1%微晶纤维素的结合率分别为3.7%和7.6%,而PATx和reAnxA无结合微晶纤维素的能力。PATx、reAnxA和reTfxA均无纤维素酶活性。PATxX纤维素酶的最适温度和最适pH分别为60℃和pH6.0。SDS-PAGE结果表明，PATxX的相对分子量为33.01 kDa,与理论推算的分子量(32.15 kDa)相吻合。通过与TfxA的连接序列和木聚糖结合域融合,使PATx具备了结合水解纤维素的能力。