木鳖子提取物对于口蹄疫、禽流感及法氏囊疫苗的免疫佐剂作用研究

【摘要】： 疫苗免疫是预防动物传染病的一个重要手段。佐剂是提高疫苗免疫效果的一个重要成分。迄今人们已经发现许多物质具有佐剂活性,但是只有少数被许可在实际中使用。许多具有免疫佐剂活性的物质由于其毒性作用而限制了其实际应用。为了寻找低毒性的高效新佐剂,我们对木鳖子的提取物ECMS在促进体液免疫和细胞免疫方面的佐剂作用进行了研究。木鳖子作为中药使用已经有1000多年的历史。就我们所知,虽然木鳖子的药用价值有许多记载,但其免疫佐剂作用方面的研究却鲜有报导。本研究主要采用醇提法获得木鳖子的提取物ECMS。鲎试验检测表明ECMS的内毒素含量低于0.5内毒素单位(EU)／毫升,排除了实验过程中内毒素对实验结果的干扰。为了探讨ECMS的佐剂活性,本文以小鼠、奶牛和鸡为实验动物,研究ECMS对口蹄疫疫苗、禽流感苗及法氏囊疫苗免疫的佐剂作用。本文还研究了口蹄疫疫苗奶牛后海穴注射的免疫效果。 选取ICR小鼠为实验动物,研究ECMS以及ECMS与矿物油联合使用对亚洲Ⅰ型口蹄疫抗原的免疫佐剂作用。试验一,28只ICR小鼠随机分成如下4组：1)口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒抗原+50μg ECMS (n=5); 2)口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒抗原+200μgECMS (n=9); 3)口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒抗原+800μg ECMS (n=5); 4)口蹄疫亚洲Ⅰ型病毒抗原组,作为阴性对照(n=9)。分别在第1,第21天进行两次免疫,并在二免后第15,30和第45天分别采血。二免后两周分别从对照组和200μg ECMS组取四只小鼠进行淋巴细胞增殖试验。结果显示,与对照相比,200μg ECMS组小鼠总抗体水平在各采血时间点均显著得到了提高(P0.05或P0.01)。二免后第30和第45天,800μg ECMS组小鼠总抗体水平显著高于对照组(P 0.05)。50μg ECMS组小鼠总抗体在各采血点均高于对照组,但无统计学差异。在二免后第15和第30天,800μg ECMS组血清IgG1抗体OD值显著高于对照组(P0.05)。其他各组小鼠血清IgG1与对照组比较均无显著性差异。800μg ECMS组(二免后第15和第30天)和50μg ECMS组(二免后第30和第45天)血清IgG2a抗体显著高于对照(P0.05或P 0.01)。200μg ECMS组血清IgG2a抗体OD值不同时间检测未发生变化。二免后第15天,800μg ECMS组血清IgG2a抗体显著高于同一时间点其他各组(P0.05或P0.01),并且此时200μg ECMS组IgG2a抗体OD值显著高于对照组(P0.05)。二免后第30天,800μg ECMS组血清IgG2a抗体显著高于对照组(P0.05)。而在二免后第45天,IgG2a在各组间未见统计学显著性差异。在二免后第15,30和第45天,800μg ECMS组血清IgG3抗体均高于对照(P0.05或P0.01)。并且,在二免后15天,ECMS组血清IgG3抗体显著高于其他佐剂免疫组(P0.05)。在ECMS组(二免后第15和第45天)和ECMS组(二免后第15天),血清IgG3抗体显著高于对照(P 0.05). ECMS佐剂组小鼠淋巴细胞经抗原刺激后,其刺激指数与对照组比较具有极显著差异(P0.01)。 试验二,研究ECMS与油佐剂联合使用的佐剂作用效果。23只小鼠随机分成3组：1)油乳化口蹄疫亚洲Ⅰ型抗原疫苗(n=9),作为对照组；2)油乳化口蹄疫亚洲Ⅰ型抗原疫苗+200μg ECMS组(n=9)；3)油乳化口蹄疫亚洲Ⅰ型抗原疫苗+800μgECMS组(n=5)。分别在第1,第21天进行两次免疫,并在二免后第15,30和第45天分别采血。二免后三周分别从对照组和200μg ECMS组取四只小鼠进行淋巴细胞增殖试验。结果表明,在二免后第15天和第30天,800μg ECMS组总抗体水平显著高于对照组(P0.05)。IgG1抗体水平方面,各ECMS组均高于对照,但均无显著性差异。二免后第15天,200μg ECMS组小鼠血清IgG3抗体水平显著高于对照(P0.05)。淋巴细胞增殖试验中,ECMS组刺激指数仅在平均值上高于对照,无统计学差异。 在青年奶牛,犊牛和泌乳奶牛进行ECMS对口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价苗佐剂作用研究。 18头青年奶牛随机分成3组(n=6),分别免疫：1)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗,对照；2)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+0.5mg ECMS组；3)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。结果为,在免疫后第60天和第90天,2mg ECMS佐剂组间接血凝效价显著高于对照组(P0.05)。免疫后第30天,0.5mg ECMS组血清抗VP1抗体水平显著高于对照组(P0.05),而2mg ECMS组抗体水平虽高于对照,但并无统计学差异。在免疫后第60天和第90天,2mg ECMS组抗VP1抗体OD值显著高于对照(P0.05),而0.5mg ECMS组高于对照,但无显著性。在免疫后第30天和第60天,2mg ECMS组血清抗口蹄疫亚洲Ⅰ型总抗体OD值显著高于对照,而2mg ECMS组血清抗口蹄疫O型总抗体水平在免疫后第60天和90天均显著高于对照(P0.05)。 12头年青母牛随机分成2组(n=6),分别免疫：1)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗,对照；2)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60和90天,分别采血,进行间接血凝试验和ELISA检测,以及经亚洲Ⅰ型,O型抗原刺激和Con-A, PHA刺激的淋巴细胞增殖试验。结果表明,ECMS组在所有采血时间点的间接血凝滴度均显著高于对照组(P0.05或P0.01)。在免疫后第60和90天,ECMS组血清抗口蹄疫亚洲Ⅰ型总抗体OD值和抗O型总抗体OD值均显著高于无佐剂组(P0.05)。淋巴细胞增殖试验结果显示,ECMS佐剂组经抗原或Con-A, PHA刺激的刺激指数均显著高于对照(P0.01)。 14头泌乳奶牛随机分成2组(n=7),分别免疫：1)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗,对照；2)口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60和90天,分别采血进行抗体检测。在免疫后第60和90天,ECMS组血清IgG抗体OD值显著高于对照(P0.05或P 0.01)。ECMS组在所有采血时间点血清抗O型抗体OD值均显著高于对照组(P0.05)。 另外,还研究了不同穴位免疫口蹄疫双价苗和ECMS佐剂,探讨针灸穴位对ECMS佐剂作用的影响。试验一,3组泌乳奶牛(n=7),分别进行1)颈部肌肉注射2ml口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗,对照；‘2)颈部肌肉注射2ml口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组；3)后海穴注射2ml口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型双价油佐商品苗+2mg ECMS组。在免疫前和免疫后第30,60,90和120天分别采血,检测抗O型血凝效价。结果显示,在各采血点ECMS组间接血凝效价均显著高于对照组(P0.05或P0.01)。后海穴免疫疫苗的ECMS组平均间接血凝效价均高于肌肉注射的ECMS组,但仅在免疫后第120天采集血清的间接血凝效价与肌注相比有显著差异(P0.05)。外周血分离的淋巴细胞分别经口蹄疫亚洲Ⅰ型和O型抗原刺激后,ECMS组刺激指数均显著地高于对照组(P0.05或P0.01),而穴位注射组刺激指数虽高于ECMS肌肉注射组,但并无显著性差异。 试验二,1)后海穴免疫lml口蹄疫双价商品苗,对照组(n=6)；2)后海穴免疫1ml口蹄疫双价商品苗+2mg ECMS,为实验组(n=6)。在免疫前和免疫后第30,60和90天分别采血。ECMS佐剂组血清抗亚洲Ⅰ型口蹄疫总抗体水平在所有采血时间点均高于对照,但仅在免疫后第60天出现显著性差异(P 0.05)。ECMS佐剂组血清抗O型口蹄疫总抗体在所有采血时间点同样高于对照,但仅在免疫后第60和90天出现显著性差异(P0.05或P0.01)。免疫后第30天,ECMS组间接血凝效价显著高于对照组血清(P0.05)。 在鸡的免疫试验中,研究了ECMS对禽流感抗原的佐剂作用。试验一,60只两周龄雏鸡(n=1-)根据如下分组1)禽流感H5N1疫苗对照组；2)禽流感H5N1疫苗ECMS组；3)禽流感H5N1疫苗ECMS组；4)禽流感H5N1疫苗ECMS组；5)禽流感H5N1疫苗+40μg ECMS组；6)禽流感H5N1疫苗+80μg ECMS组。在免疫前和免疫后第7,14和28天分别采血。结果表明,所有ECMS组的总抗体平均OD值都高于对照组,但仅在免疫后第28天的ECMS组和ECMS组与对照相比有统计学差异(P0.05)。同时,20μg ECMS组的鸡平均日增重显著地高于对照组(P0.05),指示ECMS的使用不会对日增重产生不良影响。试验二选取50只雏鸡(n=25)进行对照组和20μg ECMS组比较试验,结果同样证实,不同时间点ECMS组血清血凝效价均得到了显著提高(P0.05)。 在研究ECMS对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的佐剂作用中,52只雏鸡(n=13)分组情况如下1) IBDV疫苗,作为对照组；2) IBDV疫苗+20μg ECMS组;3)IBDV疫苗+40μg ECMS组;4) IBDV疫苗+80μg ECMS组。结果表明,ECMS均能提高总抗体水平,并且在免疫后第14,21,28和35天检测,20μg ECMS组与对照组相比,能显著性提高抗体OD值(P0.05)。ECMS组淋巴细胞刺激指数也显著高于对照组(P0.05或P0.01)。同时,ECMS对鸡各项生长指标均无不利影响,并见有ECMS组鸡平均日增重显著高于对照组(P0.05或P0.01)。综合上述研究结果,我们认为,ECMS对牛用口蹄疫疫苗,鸡禽流感疫苗和鸡传染性法氏囊疫苗均具有显著的免疫佐剂作用,提示ECMS可作为佐剂进行进一步的研究和开发。