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猪圆环病毒衣壳蛋白抗原表位的精细定位与间接ELISA检测技术

商绍彬  
【摘要】: 猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)属圆环病毒科,为单链、环状DNA病毒,包括猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。PCV1无致病性,PCV2有致病性。PCV2基因组全长1768nt或1767nt,PCV1基因组全长1759nt,均具有潜在的11个阅读框。目前已知,ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白,ORF2编码与宿主免疫相关的Cap蛋白,ORF3编码与复制无关、与致病性有关的蛋白。PCV2是引发猪圆环病毒病(PCVD),导致猪群免疫抑制,给养猪业造成了巨大的经济损失。尽管目前众多学者以PCV2 Cap蛋白为靶抗原构建了各种各样的PCV2的疫苗,但对其如何诱导免疫反应以及PCV1、2 ORF2诱导的免疫反应之间的差异在哪里不甚清楚。为此,本课题对PCV1和PCV2 Cap蛋白的抗原特性进行了较为深入的分析,并建立了用于PCV2感染血清学检测的ELISA方法。 采用去除PCV Cap蛋白核定位信号(Nuclear localization signal)的策略,以PCV DNA为模板,设计特异性引物,分别扩增了截短的PCV2衣壳蛋白(PCV2-dCap)和PCV1衣壳蛋白(PCV1-dCap)基因,进而分别克隆至原核表达载体pGEX-4T-1和pET28a(+)中,成功构建重组载体pGEX-PCV2-dCap和pET-PCV1-dCap。经表达条件优化,PCV2重组GST-dCap融合蛋白以可溶形式表达,最佳表达条件为0.1mM IPTG,37℃诱导4h;PCV1重组His-dCap蛋白以包涵体形式表达,在37℃、经1mM IPTG终浓度诱导4h可获得充分表达。采用GST亲和层析纯化,获得了48kD的PCV2 GST-dCap融合蛋白和切去GST的dCap蛋白(22kD);采用Ni-NTA亲和柱纯化,获得了28kDa的变性PCV1 His-dCap蛋白。PCV2 GST-dCap蛋白和PCV1His-dCap蛋白的表达量分别可达6.14mg/L菌液和36mg/L菌液。Western blot结果表明PCV2GST-dCap融合蛋白和dCap蛋白都能与猪PCV2阳性血清发生特异性反应;而PCV1 His-dCap蛋白与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,与选用的猪PCV2阳性血清不发生反应。 以PCV2重组dCap蛋白、PCV2病毒粒子和PCV1 His-dCap蛋白为抗原分别免疫小鼠,应用杂交瘤细胞融合和有限稀释克隆技术制备针对PCVCap蛋白的特异性单抗。分别采用间接ELISA、IFA和Western blot筛选及鉴定杂交瘤细胞上清。结果,以PCV2重组Cap蛋白为免疫原,获得了5株(1B3、1B9、8A12、8B12、8C12)针对PCV2天然Cap蛋白的单克隆抗体(mAb)分泌细胞,4株(3F6、5A3、5E11、6E1)针对PCV1、2天然Cap蛋白的单克隆抗体分泌细胞,1株(4C3)仅针对PCV1、2重组表达Cap蛋白的单克隆抗体分泌细胞;以纯化的PCV2病毒粒子为免疫原,获得了4株(1E3、2B1、6H9、7F5)针对PCV1、2天然Cap蛋白、但不与PCV1重组表达Cap蛋白反应的单克隆抗体分泌细胞;以PCV1重组表达的Cap蛋白为免疫原,获得10株(1A11、4A2、1D11、2D4、2F5、4F5、3F11、2G9、3G7、3H1)针对PCV1天然Cap蛋白的单克隆抗体分泌细胞,1株(4H7)针对PCV1、2天然Cap蛋白的单克隆抗体分泌细胞。除mAb 5A3、3F11、3G7、2G9、1A11为IgG2b和mAb 7F5、2F5为IgG2a外,其余mAb均为IgG1亚类。所有单抗的轻链均为κ链。中和试验表明,制备的mAb中,来源于PCV2重组Cap蛋白的mAb 3F6和来源于纯化PCV2病毒的mAb 6H9具有阻止PCV2病毒感染细胞的能力,来源于纯化PCV2病毒的mAb 1E3、7F5则能同时中和PCV1和PCV2粒子,说明mAb 1E3、7F5是识别PCV1、2共同抗原表位的功能性单克隆抗体,而mAb 3F6、6H9是仅识别PCV2特有抗原表位的功能性单抗。 采用合成肽技术,利用已获得的针对PCV衣壳蛋白的单克隆抗体以及PCV2多克隆抗体,对PCV衣壳蛋白的线性B细胞抗原表位进行了鉴定。试验结果表明,所试验的25株抗Cap蛋白的mAb中,仅5个线性B细胞表位为14株单克隆抗体识别,分别为:mAb 8A12、8B12和8C12识别PCV2 Cap蛋白C末端231LNP233表位;mAb 1B3和1B9识别PCV2 Cap蛋白的195HVGLGTAF202表位;mAb 4C3识别PCV1、2 Cap蛋白的175QPNNKRNQLWLRLQTAGN192表位;mAb 3G7识别PCV1、2 Cap蛋白的156YHSRYFT162表位;mAbs 4F5、4H7、3F6、1E3同时识别PCV1、2 Cap蛋白156YHSRYFT162和175QPNNKRNQLWLRLQTAGN192两个表位;mAbs 3F11、2G9和2D4识别PCV1 Cap蛋白的92LPFQYYRIRKAK103表位。氨基酸突变分析表明,231LNP233表位中233位的脯氨酸是该表位的和PCV2型特异性的关键氨基酸。利用PCV2猪多抗分析了PCV2 Cap的线性B细胞抗原表位谱,其B细胞抗原表位主要位于氨基酸残基25-42,55-72,95-112,115-142,156-192,216-233之间;对PCV2感染或PCV2 Cap真核质粒免疫后不同时期采集的猪血清中各抗原表位抗体的动力曲线分析表明,不同个体对各抗原表位的免疫反应性不同,其中,表位115DRGVGSSAVILDDNFVTK132、156YHSRYFT162、175QPNNKRNQLWLRLQTAGN192、231LNP233为免疫优势表位,但均只在感染后28-35天以后才可检测到相应抗体。对表位231LNP233检测PCV2 Cap抗体的潜力评估表明,231LNP233是PCV2Cap潜在的新的血清学标志。 以重组表达的GST-dCap融合蛋白为抗原,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.24μg/ml,包被液为0.05M pH8.5的Tris-HCl缓冲液;待检血清1:400稀释,酶标抗体为1:2000;5%脱脂奶为封闭液;含0.05%吐温-20的磷酸缓冲液作样品稀释液;待检血清和酶标二抗反应时间为30min,底物反应时间10min。以S/P值等于0.16作为PCV抗体阴、阳性血清判定的临界值。特异试验表明:建立的方法不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病毒等阳性血清发生交叉反应。同批抗原制备的不同检测板变异系数(CV)值在1-13%之间,不同批抗原制备的检测板CV值在5-22%之间。本方法与间接免疫荧光试验相比,阳性符合率为95.28%、阴性符合率为94.09%、总符合率为95.09%。与PCV2全病毒ELISA相比,本试剂盒的阳性符合率为93.3%,阴性符合率为84.2%,总符合率为91.14%。与基于PCV2型特异的多肽ELISA相比,本试剂盒的阳性符合率可达93.8%,阴性符合率为88.9%,总符合率为92.4%。与西班牙INGENASA公司的PCV2抗体试剂盒比较,本方法的诊断敏感性为91.1%,特异性为90.2%,二者符合率达90.5%;应用建立的PCV2抗体检测方法检测人工感染猪PCV2抗体消长规律发现,感染猪PCV2抗体在感染后14-21天阳转,于35-49天达到高峰,与IFA检测结果相符。表明dCAP-ELISA检测方法能够体现PCV2感染后真实的抗体动态变化。上述结果表明,所建立的PCV2抗体ELISA检测技术具有高度的特异性和敏感性。


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