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家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂b1编码基因Ict-H启动子特性分析

赵巧玲  
【摘要】: 家蚕基因组框架图的绘制完成,标志着家蚕分子生物学进入了后基因组时代。家蚕是鳞翅目的一种重要模式昆虫,对其生理、病理和天然免疫机理的研究,不仅有助于解明家蚕的抗病机制,从而培育抗病家蚕品种,而且将为农林害虫防治新技术的研究提供理论依据。 通过对家蚕基因组分析,发现有69个与免疫和防御相关基因。而蛋白酶抑制剂是昆虫的天然性免疫系统不可缺少的组成部分。家蚕血液中存在的Kunitz型胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor) CIb1,参与调节控制细菌侵染引起的黑化形成反应,可能在家蚕的天然性免疫反应路径中担任重要角色。本研究通过对家蚕蛋白酶抑制剂CIb1编码基因Ict-H启动子特性的分析,初步阐明了其启动子的结构、上游调控元件,明确了BmNPV感染对Ict-H启动子发生作用的主要病毒因子,并研究了热刺激、外源昆虫激素等对Ict-H启动子活性的影响,为进一步开展家蚕抗病机制和免疫机理的研究建立了基础,并为其它昆虫相关研究提供借鉴。 1、初步阐明了家蚕Ict-H启动子的结构和上游调控元件根据BGI-Sikworm数据库登录的家蚕lct-H启动子序列(AADK01017234.1)设计合成PCR引物,PF1、PF2、PF3、PF4、PF5和PR,分别对应Ict-H转录起始位点上游—824~—816 nt、—672~—649 nt、—506~—482 nt、—302~—282 nt、—72~—51 nt和互补链—16~+10 nt。从“p50”基因组克隆Ict-H启动子,构建Ict-H启动子萤火虫荧光素酶基因(luc)报告质粒,体外(家蚕BmN培养细胞)分析其活性,并通过缺失分析研究了该启动子的结构及其上游调控元件。结果显示,844 bp家蚕Ict-H基因启动子片段包含Bml元件、TATA盒、CCAAT元件(互补链上)、LPS应答元件CATTW、转录因子NF-κB结合位点序列GGGAACTCCT和GATA盒等元件。不同长度的Ict-H启动子活性存在明显的差别:82 bp启动子片段包含真核基因核心启动子元件,因此仍具有基本的转录活性;312 bp启动子片段的活性极显著高于82 bp启动子,提示在—303~—74 nt区段其中存在Ict-H基因转录正调控元件;但是,当启动子片段长度达到516 bp时,转录活性反而急速下降,提示在—506~—303 nt区段存在强力抑制基因转录的负调控元件;而Bml(—624~—423)元件对Ict-H启动子转录活性具有正向调节作用,当启动子片段长度达到682 bp和844 bp时,即分别包含部分和全部Bml元件,转录活性又相应提高。 2、发现家蚕Ict-H启动子在品种间存在多型性用引物PF2和PR克隆Ict-H启动子时,以p50基因组DNA为模板只获得1种长度的片段;以“苏·菊×明·虎”群体基因组DNA为模板获得4种不同长度的片段(682bp,696 bp,550 bp和564 bp),且它们具有很高的相似性,称之为Ict-H启动子类似片段。那么这些不同片段是不同基因的启动子,还是同一基因的启动子存在多型性呢?为了解释这一现象,又分别以“苏·菊×明·虎”及亲本品种“苏”、“菊”、“明”、“虎”和“p50”、“C108”基因组DNA为模板,用PF2和PR引物克隆了Ict-H启动子类似片段,并进行测序。序列分析表明,从“p50”、“苏”、“菊”三个品种克隆的Ict-H启动子与BGI-Sikworm数据库登录的Ict-H启动子序列相似性达99.17%,命名为基本型。从“C108”、“明”和“虎”三个品种克隆的Ict-H启动子,缺失了基本型中—517~—386 nt的132 bp片段,但在—122~—121 nt间插入了1个14 bp序列正向重复序列AACGATATCATGCA,命名为缺失插入型。“苏·菊×明·虎”,除具有其亲类型外,增加了2种新类型:一种为缺失型,缺失了基本型—517~—386nt的132bp片段;另一种为插入型,在基本型的—122~—121nt间插入了1个14 bp序列。 为了进一步查明4种Ict-H启动子类似片段是否都控制Ict-H基因,在Ict-H基因第1外显子内设计反向引物,分别以“苏”、“虎”和“苏·菊×明·虎”基因组DNA为模板,克隆带有启动子和部分第一外显子的DNA片段。序列分析表明,从“苏”获得的片段只有基本型;从“虎”获得的片段只有缺失插入型;从“苏·菊×明·虎”获得的片段有基本型、插入型、缺失插入型和缺失型4种,说明上述4种启动子类似片段都与Ict-H基因相连,即Ict-H基因的启动子具有多型性。 “苏·菊×明·虎”4种类型的Ict-H启动子片段恰好为启动子特性分析提供了天然的缺失、插入突变模型。体外瞬时表达分析显示,不同类型的家蚕Ict-H启动子活性相差甚远,基本型活性较低;缺失型活性特别高,大约是基本型的5000倍,说明缺失的132 bp片段对启动子活性有很大影响。插入型活性最低,缺失插入型活性极显著低于缺失型,说明14 bp的插入明显抑制该启动子的活性。 3、BmNPV感染增强Ict-H启动子转录活性在体外条件下研究了BmNPV感染对Ict-H启动子活性的影响。结果显示,BmNPV感染能增强Ict-H启动子转录活性,说明Ict-H启动子对BmNPV感染有应答反应。但病毒(或其因子)对不同长度的Ict-H启动子活性的增加倍数有明显的差异,其中682 bp和516 bp活性增加幅度大,而844 bp、312 bp和82 bp增加幅度较小。时相分析表明,BmNPV对启动子的作用最早在感染后3h左右。BmNPV极早期蛋白IE-1也能显著增强Ict-H启动子活性,说明IE-1可能是增强Ict-H启动子活性的主要病毒因子之一。BmNPV hr3作为增强子能显著增强Ict-H启动子活性,而hr3作为反式作用的病毒因子时,需要BmNPV或IE-1的激活。 4、BmNPV感染影响家蚕体内CIbl的表达用BmNPV感染家蚕幼虫,以蒸馏水处理的家蚕为对照,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色技术,调查了BmNPV感染对家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂CIb1活性的影响。结果表明:无论是经口接种还是注射接种,BmNPV感染24 h内家蚕血液中CIb1蛋白量减少,而24 h后CIb1蛋白量与对照相比几乎无差异,这进一步说明CIb1在家蚕天然性免疫中具有重要的作用。 5、家蚕Ict-H缺失型启动子兼具组成型和诱导型特征 家蚕Ict-H基因550 bp缺失型启动子驱动的荧光素酶基因报告质粒,不仅能在家蚕卵巢来源的BmN细胞、家蚕体内(血淋巴)表达,而且能在秋粘虫来源的Sf9细胞中表达,说明该启动子属于组成型启动子。但是报告质粒在家蚕来源的细胞中表达水平高,在非家蚕来源的细胞中表达水平低,表明该启动子具有一定的种特异性。 体外(BmN)调查了BmNPV感染、IE-1表达质粒pT-ie-1共转染,添加LPS或外源昆虫激素MH、JHA、DH以及37℃热刺激,对550 bp缺失型启动子活性的影响。结果表明:BmNPV、病毒因子IE-1 (pT-ie-1)、热刺激对550 bp缺失型Ict-H启动子的活性有激活作用,说明550 bp缺失型启动子又具有诱导型特征,病毒入侵时Ict-H的转录水平提高,以增加CIb1的浓度抵御病毒入侵带来的影响。而LPS、MH、JHA对550 bp缺失型启动子活性有抑制作用;DH无明显影响。


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