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奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳分型及其主要毒力因子和耐药性的研究

李建平  
【摘要】: 乳房炎是危害奶牛养殖业的主要疾病,金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原。为了解我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行株的特性及其在各地的分布特点,本论文对来自我国浙江、新疆等14个省区的191株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株应用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)技术进行了分子分型和耐药性分析。在此基础上,研究了这些细菌携带超抗原基因和PVL基因的情况及其与PFGE分型的关系;对主要流行株ClfA基因进行了克隆、表达,以及其他相关研究。 1.规模牛场奶牛全年主要疾病的发病调查 为了解规模奶牛场奶牛主要疾病的发病情况,对一个1100头奶牛的规模奶牛场进行了一年内奶牛发病的调查。结果显示,该场成年母牛病例数排在前几位的疾病是乳房炎(20.9%)、关节炎(20.7%)、前胃迟缓(7.7%)、腐蹄病(4.1%)、胎衣不下(4.0%)和子宫内膜炎(2.5%)。乳房炎的发病率为55.9%,是发病率最高的疾病,其次是关节炎(55.1%)和前胃迟缓(19.0%)。八月份是临床型乳房炎发病的高峰期,表明季节对乳房炎的发生有影响。关节炎的发病率仅次于乳房炎,可能与该场未使用运动场有关。 2.浙江省主要奶牛养殖区隐性乳房炎的发病及主要病原调查 为了解浙江省主要奶牛养殖区奶牛乳房炎的发病情况及其主要病原,对杭州、金华、宁波和台州30个规模和个体奶牛养殖场共846头泌乳牛用杭州奶牛乳房炎诊断法(HMT)进行了隐性乳房炎检测。采集阳性“++”和强阳性“+++”乳区奶样进行了细菌学诊断。结果表明,浙江省奶牛隐性乳房炎的平均头阳性率为54.3%,平均乳区阳性率为28.0%。与此相比,宁波地区乳房炎头阳性率和乳区阳性率最高,分别为69.7%、36.4%(P<0.01),台州地区最低,分别为40.8%、21.8%(P<0.01)。奶牛头数超过300头的规模牛场隐性乳房炎头阳性率为58.2%,乳区阳性率为30.0%,而小型牛场(≤300头)分别为50.0%(0.01<P<0.05)和25.0%(P<0.01),均低于大型规模牛场。 阳性乳区奶样细菌学分析结果显示,无乳链球菌检出率为27.0%(17.9~38.7%),金黄色葡萄球菌的检出率为12.2%(3.3~27.9%),提示传染性病原菌是浙江省奶牛乳房炎的主要病原。除凝固酶阴性葡萄球菌(P>0.05)外,大型规模牛场(>300头)无乳链球菌(P<0.01)、金黄色葡萄球菌(P<0.01)的检出率均高于小型牛场,小型牛场则以乳房链球菌(P<0.01)和停乳链球菌(P<0.01)为主。 凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的检出率最高(34.0%)。尽管CNS作为奶牛乳房炎病原在其毒力、致病性等方面还有争议,但从本研究结果看,对CNS引起的乳房炎应给予重视。 3.我国14个省区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行株的分子分型 为了解我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌流行株情况,本研究对来自浙江、新疆、山东、内蒙古、上海、北京、天津、河北、甘肃、陕西、河南、安徽、重庆、广东等14个省区的191株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌应用PFGE分型技术进行了分子分型。结果显示,共有15个PFGE型别,其中5个为主要型别(A,B,C,D,E),占全部菌株的91.1%。5个型别中,A型占所有被检菌株的56.5%,在13个省区检查到,是我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要的流行株。从流行区域看,A型株主要在我国南部、东南及中部地区流行,而北方省区尽管有A型株流行,但有各自不同的优势株,如山东、内蒙主要流行C型株,D型株仅在新疆发现。在我国流行的A型株与北美奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌标准菌株Newbould 305 (ATCC 29740)有高度的相似性,其相似度在85%以上。浙江省流行的乳房炎金黄色葡萄球菌PFGE型别与其他省区相比有明显不同。在总共15个PFGE型别中,浙江有11个型。这可能与浙江省奶牛交易流动频繁有关。不同牛群倾向于有自己的优势株,并在一定时期内保持稳定。 4.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药情况 对浙江省四个奶牛养殖区23个奶牛场分离到的75株金黄色葡萄球菌进行了药敏试验。结果表明,90.7%的菌株耐药,其中77.3%(60.0~88.9%)的菌株对青霉素耐药,不同地区分离到的细菌耐药情况有差别。新疆43株菌全部耐药,其中青霉素耐药菌株达到93.0%,但对四环素(23.3%)、克林霉素(9.3%)和庆大霉素(16.3%)耐药率要小于浙江省分离到的菌株(60.0%、29.3%、28.0%)。所有新疆菌株对环丙沙星敏感,而8.0%的浙江菌株对环丙沙星耐药。这些结果表明,地理环境的差异对金黄色葡萄球菌耐药有影响。 多重耐药现象普遍,对两种及两种以上药物耐药的分离菌占94.1%,有的菌株对4-6种药物同时耐药。值得注意的是,金黄色葡萄球菌乳房炎分离株对非乳房炎临床治疗药物如克林霉素、四环素、红霉素、氯霉素等存在不同程度的耐药,提示奶牛场在治疗其他感染性疾病时的用药可能影响乳房炎金黄色葡萄球菌的耐药。 在受试的12种药物中,金黄色葡萄球菌耐药与PFGE主要型别未见相关性。 5.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的毒力因子 对来自浙江、新疆等14个省区的191个奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株进行了超抗原基因的检测,包括肠毒素基因A-E、G-J以及L、毒性休克综合征毒素1(TSST-1)、剥脱毒素ETA和ETB。结果显示,在被调查的13个超抗原基因中,有72株菌(37.7%)至少携带一种超抗原基因。sei(53,27.7%)、seg(25,13.1%)和sea(15,7.9%)的检出率最高,see、eta、etb未检测到。菌株主要超抗原基因类型为sei(28,14.7%)、seg-sei(18,9.4%)、sea(9,4.7%)。研究发现,菌株超抗原基因分布类型与PFGE分型有相关性。我国主要流行的A型株很少携带超抗原基因(3.7%)(P<0.01),而B型(76.2%)、C型(92.3%)、D型(54.5%)、E型(50.0%)菌株携带超抗原基因的比例很高,C型株又以sei(84.6%)为主,D型和E型则主要是seg-sei类型。这些结果提示,不同PFGE型别的金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺的致病性可能不同。 191株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株中仅有一株细菌PVL (Panton Valentine leucocidin)基因检测结果为阳性,提示杀白细胞毒素在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺的过程中不起主要作用。 6.金黄色葡萄球菌ClfA基因克隆及表达 凝聚因子A(Clumping Factor A, ClfA)是金黄色葡萄球菌重要的黏附分子,在金黄色葡萄球菌感染中起重要作用。依据已发表的ClfA基因的序列分析,选择金黄色葡萄球菌ClfA基因的A区(40-559aa)作为原核表达的对象,以我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌主要流行株A型株为试验菌,应用PET融合表达系统对ClfA基因进行了高效表达,构建了原核表达重组质粒pET-His-ClfA。经IPTG诱导,SDS-PAGE和小鼠多克隆抗体Western blotting分析证实,所表达的目的蛋白具有较好的免疫原性。研究中还发现ClfA分子的特异移动现象,即克隆表达的目的蛋白预期分子量小于SDS-PAGE显示的分子量。这部分工作为进一步研发针对奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的治疗性疫苗以及亚单位疫苗奠定了基础。 综上所述,根据PFGE分型技术,我国奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌存在主要流行株,该流行株很少携带超抗原基因且与北美奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌标准株Newbould 305(ATCC 29740)有高度相似性,主要分布在我国南部、东南及中部省区,而北方省区如新疆、山东以及内蒙古有其独特的流行株。不同PFGE型别菌株与超抗原基因类型有相关性,与12种受试药物耐药未见相关性。浙江省奶牛乳房炎以传染性病原为主,临床型乳房炎是规模奶牛场最主要的疾病。


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