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对虾白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂及多糖对克氏原螯虾抗WSSV作用的研究

朱斐  
【摘要】: 对虾白斑综合征病毒(WSSV)是对全球对虾养殖业危害最大,传播最广的病毒之一,尤其是对中国对虾养殖业带来了毁灭性的打击,至今已经造成了数十亿美元的损失。但目前尚无行之有效的防治手段,因此寻找预防和控制该病毒病一直是近年来的研究热点。许多研究结果表明WSSV囊膜蛋白可以诱导甲壳动物产生对WSSV的抵抗力,从而大幅提高WSSV攻毒后的成活率。多糖(如葡聚糖、壳聚糖、甲壳素)也被认为能提高甲壳动物的免疫力,并被广泛用于提高甲壳动物抗细菌性和病毒性疾病的研究。 本研究从制作WSSV灭活制剂着手,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行主动免疫保护克氏原螯虾抗WSSV感染的效果试验,并初步研究WSSV灭活制剂的保护作用机理。同时在螯虾饲料中添加不同比例(5mg/g、10mg/g、15mg/g)的三种多糖(壳聚糖、甲壳素、葡聚糖),研究多糖对克氏原螯虾抗WSSV感染的影响。主要研究内容和结果如下: 1 BEI灭活WSSV制剂(BIW)的研制 应用双乙烯亚胺(Binary Ethyleneimine, BEI)灭活WSSV,经螯虾肌肉注射试验证实白斑综合征病毒(WSSV)在2mM BEI,37℃下处理24h可以被完全灭活,注射试验表明死亡率为零,同时PCR检测也表明受试螯虾没有感染WSSV,结果表明BEI灭活WSSV制剂(BIW)对于螯虾是安全的。 对BEI灭活WSSV的PCR检测证明了BEI的作用是破坏病毒的DNA分子,虽然扫描电镜观察发现WSSV粒子的囊膜表面有轻微的变化,但是SDS-PAGE分析说明结构蛋白的基本组成几乎没有改变,在灭活后WSSV的主要囊膜蛋白VP19. VP28. VP281、VP38A、VP51B和VP110等条带均清晰可辨,说明BEI的灭活作用对WSSV的囊膜蛋白基本无损坏影响,从而保持了其诱导甲壳动物抗白斑综合征的能力。 2口服BIW诱导螯虾抗白斑综合征效果的研究 结果表明口服BIW能显著提高克氏原螯虾攻毒后的相对存活率。不同次数口服免疫试验表明,随着口服BIW次数的增多,螯虾对WSSV的抵抗力也相应增强,但随着口服次数增多差异也越小,结果显示口服三次BIW就可以诱导螯虾对WSSV产生较强的抵抗力。口服三次BIW后,螯虾在第7、14、21、28天攻毒的相对存活率RPS分别为70%、53%、38%和20%,均显著高于对照组(P0.05)。但是口服BIW螯虾的死亡率随着攻毒时间的推后也持续的升高,存活率随之下降,在14天之内口服BIW的螯虾可以保持50%以上的存活率。 口服BIW的螯虾在口服结束后第一天血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力和溶菌酶活力均有一定程度的提高,但差异不显著(P0.05);口服BIW结束后第七天四种酶活力水平有显著的提高(P0.05),后逐步下降,至第4周基本与对照组无明显差异。PCR检测结果发现,病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织的PCR结果均为WSSV阳性,而口服BIW螯虾的各组织检测结果均为阴性。光镜和电镜观察也证实了这一点,病死螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏等组织均发生了不同程度的病变,而口服BIW螯虾的组织结构形态与健康螯虾无明显差异。 3 BIW诱导螯虾抗白斑综合征机理的研究 口服BIW的螯虾,在口服结束后第7天和第21天后攻毒存活率均显著高于对照组(P0.05),相对存活率分别为60%和42%,而口服热灭活WSSV的相对存活率仅为10%和5%。注射BIW的螯虾在免疫结束第7天和21天后攻毒存活率均显著高于对照组,相对存活率分别为75%和60%。而注射热灭活WSSV的相对存活率仅为10%和5%。另外,电镜观察发现在BEI灭活WSSV的囊膜表面仅有轻微的变化,而热灭活WSSV的囊膜则几乎从核衣壳上脱落,说明BEI灭活对WSSV囊膜的影响要比热灭活小的多。SDS-PAGE也证明了这一点,BEI灭活WSSV可见VP19、VP28、VP281等囊膜蛋白条带都十分清晰,而热灭活WSSV则未见清晰的条带。对照攻毒试验说明WSSV灭活制剂所提供的保护作用是与灭活WSSV囊膜蛋白密切相关的。 4多糖添加剂对克氏原螯虾抗WSSV影响的研究 在虾饲料中添加不同比例(5mg/g、10mg/g、15 mg/g)的三种多糖(壳聚糖、甲壳素、葡聚糖),连续投喂20天以后口服攻毒。结果发现,与阳性对照相比,壳聚糖组5 mg/g、10 mg/g和15]mg/g三个浓度的相对存活率分别为25%、40%和25%;甲壳素组三个浓度的相对存活率分别为5%、15%和15%;葡聚糖组三个浓度的相对存活率分别为20%、25%和30%。其中以10mg/g壳聚糖组的保护作用最好,15mg/g葡聚糖组次之,相对存活率均显著高于对照组(P0.05)。但同种多糖添加剂不同浓度的相对存活率之间却无显著差异(P0.05)。酶活力测定发现,壳聚糖、甲壳素、葡聚糖对螯虾酶活力的提高作用以葡聚糖最好,壳聚糖次之,甲壳素则较差。而10 mg/g壳聚糖组的酶活力水平相对较高,与该组较高的存活率相一致。结果表明,上述四种酶活力水平可能与螯虾抗WSSV的能力有一定的相关性。 研究发现,2mM双乙烯亚胺(BEI)对WSSV有确切的灭活效果,BEI灭活的WSSV经PCR检测和SDS-PAGE分析表明,BEI破坏了病毒的DNA,而对WSSV的囊膜蛋白无损坏影响,保持了其诱导甲壳动物抗白斑综合征的能力。三次可使螯虾对WSSV产生较强的抵抗力,在14天之内攻毒可以保持50%以上的存活率,且螯虾血清酚氧化酶活力、超氧化物歧化酶活力、溶菌酶活力均显著提高。通过光镜和电镜观察发现,口服BEI灭活WSSV攻毒后存活螯虾的肝胰腺、中肠、肌肉、鳃、性腺、心脏六种组织均未感染WSSV,且PCR结果均为WSSV阴性。对照攻毒试验表明,WSSV灭活制剂所诱导的对白斑综合征的抵抗力是与灭活WSSV囊膜蛋白密切相关的。


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