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单核细胞增多性李斯特菌分子进化与酸应激功能基因组学研究

陈健舜  
【摘要】: 单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)是重要的食源性人畜共患病原菌,可引发败血症、脑膜炎与流产等,致死率可达30%,远高于其它食源性病原菌。近年来,欧美国家李斯特菌病的发病率呈上升趋势。2007~2009年美国、加拿大和丹麦均暴发食源性李斯特菌病,共导致30人死亡。我国由于缺乏系统的李斯特菌病流行病学资料,目前无法评估其危害的严重性。 单增李斯特菌食品分离株间致病力各异。4b型(谱系Ⅰ)引起大多数的侵袭型李斯特菌病病例,且死亡率高于其他血清型;1/2a型(谱系Ⅱ)在食品中的分离率最高,主要引起人胃肠炎型李斯特菌病;谱系Ⅲ则很少引起人发病。单增李斯特菌的感染过程包括抵抗宿主内环境的应激、黏附并侵入细胞、细胞内增殖以及细胞间扩散,每一步均由特定的毒力因子介导。食源性病原菌通过消化道进入人体后,首先需要耐受胃液的酸性环境。因此,抗酸应激能力是单增李斯特菌建立感染的前提。无害李斯特菌常伴随单增李斯特菌出现在被污染的食品中,两者的生态、生化及基因组特征均非常相似,但无害李斯特菌不致病。因此,单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝是研究细菌致病性和毒力基因演化的良好模型。 本研究旨在探明:(1)国内食源性单增李斯特菌的分子流行病学特征与致病性;(2)单增李斯特菌谱系Ⅲ和无害李斯特菌的生物多样性及其分子进化关系;(3)单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶系统的抗酸应激功能及其分子机制。 1、食源性单增李斯特菌分子流行病学特征与致病性 基于iap与lmo0038的多重PCR反应,首次将鉴定李斯特菌各个种与区分单增李斯特菌谱系Ⅲ结合于一步检测体系中,适用于大批量样品的李斯特菌监测。2000~2007年中国13个省市李斯特菌平均污染率为3.8%,其中单增李斯特菌约占25.3%。其污染无季节性差异,肉类与水产品的受污染程度最为严重。采自浙江、福建的88株单增李斯特菌食品分离株中,1/2a型占58%,4b型仅占12%,M7与S19属于谱系Ⅲ。2007~2008年从5大洲29个国家进口的1275批水产品中,李斯特菌污染率为2.8%,与国内水产品相近(2.7%),其中单增李斯特菌所占的比例(91.7%)远高于国内水产品(22.2%),4b型(65.2%)取代1/2a型(13.0%)成为主导,并有流行克隆Ⅰ和Ⅱ检出。系统进化树中,流行克隆Ⅰ与我国病羊临床株亲缘关系较近,流行克隆Ⅱ位于1/2b型菌株间,而我国食源性4b分离株则位于独立的分枝。由此可见,进口水产品中致病性单增李斯特菌的危害风险性较高。上述菌株均含有第一毒力岛(LIPI-1)、inlAB(除S10)等主要毒力基因。除谱系Ⅲ菌株M7,绝大部分菌株对体外培养细胞和小鼠均具有较强致病力。ActA中1个赖氨酸重复区(PRR)的缺失并不影响细菌毒力,但可作为区分流行克隆Ⅰ和Ⅱ的遗传标志。谱系Ⅲ在系统进化树中位置特殊,可能为研究单增李斯特菌的进化提供线索。 2、单增李斯特菌谱系Ⅲ的多样性与分子进化 16S rRNA进化树中,单增李斯特菌谱系Ⅲ菌株位于单增李斯特菌、无害李斯特菌与玛氏李斯特菌之间。在基于21个基因的多位点序列分型中,13个谱系Ⅲ菌株位于3个主要分枝,分别代表亚系ⅢA、ⅢB、ⅢC。其中ⅢA又可分为3个亚枝ⅢA-1、ⅢA-2与ⅢA-3,弱毒株M7与54006属于ⅢA-3。基于46个生化指标的生化分型,将这些谱系Ⅲ菌株分为8个生化型:ⅢA-3为1型;4株ⅢA-1与ⅢA-2为2型;5株ⅢB分别为3-7型;2株ⅢC同属8型。基于37种内化素基因的内化素分型,则将谱系Ⅲ菌株分为10个内化素型,并可归为4类:第一类对应ⅢB,所含内化素基因数最少;第二类对应ⅢA-3;第三类对应ⅢC菌株;第四类对应ⅢA-1与ⅢA-2,包含的内化素基因最多。ascB-dapE内化素岛结构进一步将ⅢB与ⅢC分为ⅢB-1、ⅢB-2与ⅢC-1、ⅢC-2。 所有ⅢA-1、ⅢA-2、ⅢB与ⅢC菌株均具有与谱系Ⅰ和Ⅱ强毒株相似的胃液存活力、细胞黏附力、侵袭力以及细胞空斑形成能力,对正常小鼠与免疫抑制小鼠均具有致病力。但ⅢA-3在胃液的存活力仅为其他菌株的1/1000,在庆大霉素存在时不能形成细胞空斑,易被宿主清除,因而对正常小鼠与免疫抑制小鼠的致病力均很弱。所有谱系Ⅲ菌株均含有完整的LIPI-1、InlAB等毒力因子,其余内化素(如InlC、InlF、InlJ)及ActA中一个PRR重复区的缺失并不是导致ⅢA-3弱毒的原因。ⅢA-3菌株的LIPI-1毒力基因与inlAB的表达水平显著高于其他菌株,具有极强的体外溶脂活性。在ⅢA-3的PrfA转座突变株中,LIPI-1毒力基因与inlAB的表达量降至亲本株的1/10~1/1000。因此,ⅢA-3的毒力基因高水平表达可能由PrfA的过度表达引起。PrfA是单增李斯特菌最重要的毒力调控因子,ⅢA-3的PrfA第145位由甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)。该位点位于PrfA的HTH基序外侧,其突变引起PrfA空间构象改变而处于构成性激活状态,引起下游调控基因(包括膜裂解因子LLO、PC-PLC等)过度表达,细菌裂解宿主细胞的能力增强,从而使菌体暴露于机体免疫系统而被清除,进而导致弱毒。其余谱系Ⅲ菌株均为强毒株,但极少引起人发病,可能是因其在食品与环境中的分离率较低,感染人的几率较小。 ⅢA-3代表菌株M7的全基因组序列长2852640bp,编码约2970个ORF,GC含量为38.2%,高于其他谱系(37.8~38.0%)。与1/2a型、4b型强毒株相比,M7在46个区域缺失109个基因,包括ADI基因岛(lmo0036-lmo0041基因簇)、rplS-infC内化素岛、ascB-dapE内化素岛及11个疑似转录调控因子等。M7含有345个特异性基因,包括E家族毒力因子M7-28、Sigma家族蛋白M7-210、内化素M7-214与4个疑似转录调控因子等。ⅢA-3含有与强毒株相同的LIPI-1,但其23S rRNA与无害李斯特菌具有更高的同源性。基于2168个李斯特菌属保守基因的系统进化树中,ⅢA-3位于单增李斯特菌谱系Ⅰ、Ⅱ与无害李斯特菌之间。ⅢA-3既含有单增李斯特菌特异的毒力因子(如LIPI-1、InlAB、Bsh等),又与无害李斯特菌具有相似的基因缺失(如精氨酸脱亚胺酶基因岛、rplS-infC内化素岛、ascB-dapE内化素岛等)与基因插入(108个共有特异性基因),这类弱毒株可能为单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化中间体。ⅢA-3特异性含有介导细菌水平转移的多种噬菌体相关蛋白、重组酶、整合酶、转座子蛋白与CRISPR相关蛋白,提示ⅢA-3可能具有更高的水平转移发生概率。但是,ⅢA-3无法指示该进化枝的进化方向。无害李斯特菌作为进化枝的另一极,其亚群结构可能为确定该进化枝的进化方向提供重要线索。 3、无害李斯特菌的亚群结构以及单增李斯特菌-无害李斯特菌分枝的进化关系 内化素分型与多位点序列分型将无害李斯特菌分为亚群A、B、C和D。亚群A包括内化素型1与3(除菌株0063属于亚群C),亚群B包括内化素型2与4。大多数菌株(94.2%)属于这两个亚群。亚群A、B与共同祖先的遗传距离(TMRCA)相同,提示两者出现的时间相似。但亚群A的重组率显著高于亚群B,包括重组的相对发生频率(r/m)及相对影响程度(ρ/θ)。绝大多数亚群A菌株含有完整的无害李斯特菌特异性内化素与单增李斯特菌-无害李斯特菌共有内化素。溯祖(Coalescent)模型提示亚群A近期经历了种群规模的扩张。因此,亚群A可能代表了无害李斯特菌环境适应性的进化方向。除亚群D菌株L43含有inlJ,无害李斯特菌缺失其他与黏附、侵袭、细胞内感染相关的基因,对小鼠均无致病力。无害李斯特菌的序列多态性显著低于单增李斯特菌,为相对年轻的菌种。因此,该分枝的进化方向是由单增李斯特菌至无害李斯特菌,代表细菌致病力由强变弱的罕见案例。 亚群D对应于内化素型5,在进化树上偏离其他亚群,可能是单增李斯特菌与无害李斯特菌的另一进化中间体。可通过丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶与丙氨酸芳胺酶反应活性与无害李斯特菌其他亚群相区别。较之亚群A菌株CLIP 11262,L43在全基因组的50个区域缺失365个基因。其中部分为L43与单增李斯特菌共同缺失,部分为进化中间体L43与单增李斯特菌ⅢA-3特异缺失。L43含有单增李斯特菌特异性黏附因子InlJ,但在第11个赖氨酸重复区具有7个核苷酸的错位缺失,代表首例提前终止的InlJ。 综上所述,提出单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化模型。单增李斯特菌1/2c型(谱系Ⅱ)代表最古老的类群,存在至少3条进化途径:一条进化为谱系Ⅰ,经1/2b至4b;一条通向ⅢB(由ⅢB-1至ⅢB-2);另一条则进化为1/2a型(谱系Ⅱ)和ⅢA-/-2,后者进而分化为ⅢA-3与ⅢC (ⅢC-1至ⅢC-2)。单增李斯特菌ⅢA-3为进化中间体,并经由另一进化中间体无害李斯特菌亚群D,向无害李斯特菌进化(由亚群C至亚群A、B)。 4、单增李斯特菌酸应激功能基因组学研究 通过Solexa基因表达谱分析技术,在全基因组水平上比较单增李斯特菌参考菌株10403S在中性(pH 7.0)与酸性(pH 4.8)环境下基因的转录水平差异,发现有谷氨酸脱羧酶(GAD)系统与精氨酸脱亚胺酶(ADI)系统(lmo0036-lmo0043基因簇)在酸性环境中转录量明显上升。GAD系统含有3个同源基因gadD1、gadD2和gadD3。在酸性环境(pH 4.8)中,gadD2与gadD3的转录水平升高,而gadD1转录水平不变。表明GAD系统与单增李斯特菌的抗酸应激有关,该系统与inlGHE与inlGC2DE同步进化。 无论从分子进化或功能基因组学角度,ADI基因簇均引起了我们的关注。该.基因岛含有8个基因,包括arc家族成员arcABCD、aguA家族成员aguAl与aguA2、可能转录调控因子lmo0041与未知功能基因lmo0042,同时涵盖ADI系统与AgDI系统。这些基因在酸性条件(pH 4.8)的转录水平均显著高于中性条件(pH 7.0)。这些基因缺失株在中性BHI(pH7.0)的生长速率与亲本株无差异,但在酸性BHI(pH5.5)的生长速率低于亲本株;这种生长差异在酸性MEM(pH5.5)中更为明显。在人工胃液中,各缺失株的存活率亦显著低于亲本株。表明ADI系统是单增李斯特菌的抗酸应激系统。同时,各缺失株对小鼠的致病力显著低于亲本株。aguA1与aguA2编码双拷贝的鲱精胺脱亚胺酶(AgDI),但aguA2对单增李斯特菌的抗酸性发挥更重要的作用,对致病力的影响亦更为明显。 5、单增李斯特菌精氨酸脱亚胺酶/鲱精胺脱亚胺酶系统功能蛋白的作用机制 单增李斯特菌arc A(lmo0043)编码ADI,以精氨酸为反应底物。单增李斯特菌含有arg基因家族,可内源性合成精氨酸;又可在强酸性环境中摄取外源性精氨酸。精氨酸经ADI催化发生脱亚胺反应,生成瓜氨酸与氨。同时,aguAl(lmo0038)与aguA2(lmo0040)编码双拷贝的鲱精胺脱亚胺酶(AgDI),以鲱精胺为底物。单增李斯特菌可在强酸性环境中摄取外源性鲱精胺;又具有精氨酸脱羧酶活性,可介导精氨酸的脱羧反应生成内源性鲱精胺。鲱精胺经AgDI催化发生脱亚胺反应,生成氨甲酰腐胺与氨。AguA1与AguA2具有相似的亲水性与活性位点,但AguA2对单增李斯特菌的抗酸性具有更显著的影响。由此可见,ADI与AgDI分别启动了其相应的代谢通路。 ArcB兼具鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)与腐胺氨甲酰转移酶(PTC)的活性,催化两组可逆的氨甲酰基转移反应,为首例可同时催化4个反应方向的氨甲酰转移酶。体外的转氨甲酰反应平衡倾向于同化方向。同化反应的最适pH呈碱性(pH8~pH10),而异化反应的最适pH为酸性(pH5~pH5.5),提示OTC/PTC在酸性环境(如胃液)中主要催化异化反应。异化方向OTC催化瓜氨酸的脱氨甲酰反应,生成鸟氨酸与氨甲酰磷酸盐;而异化方向PTC则催化氨甲酰腐胺的脱氨甲酰反应,生成腐胺与氨甲酰磷酸盐。OTC与PTC活性分别推进了ADI代谢通路与AgDI代谢通路。ArcB将这两条代谢通路联系起来,发挥承前启后的关键作用。 氨甲酰磷酸盐在氨甲酰激酶CK (lmo0039)的作用下,生成二氧化碳与氨。而鸟氨酸与腐胺通过跨膜转运因子AP (lmo0037),与胞外的精氨酸或鲱精胺进行等量交换,启动新一轮的ADI与AgDI代谢循环。该循环处于动态平衡之中。在1个ADI或AgDI循环中,1 mol精氨酸或鲱精胺生成2 mol氨。在酸性环境中,氨与细胞质中的H+结合为NH4+,提高细胞质的pH,以减轻酸应激对细胞的伤害,从而增强细菌在酸性环境(如胃液)中的存活力。 ADI基因岛如此精巧的排布背后,必然有一个缜密的调控网络系统。Lmo0041属于rpiR家族转录调控因子,ArgR为精氨酸合成抑制因子,分别在胃液中负调控与正调控ADI与AgDI代谢通路,其中Lmo0041的作用强于ArgR。ArgR同时正调控Lmo0041,更加剧了Lmo0041对ADI与AgDI通路的负调控作用。ADI基因岛中存在应激调控因子SigB与毒力调控因子PrfA的结合位点,提示ArgR与Lmo0041可能受更高一级的调控因子所调控。这些调控因子可能在不同的环境条件下,选择性激活或抑制ADI与AgDI代谢通路。由此可见,ADI与AgDI系统在级联调控网络的作用下,介导单增李斯特菌的抗酸性以及致病力。 综上所述,本论文阐明了(1)国内外食源性单增李斯特菌(除谱系Ⅲ菌株M7)均具有较强的致病力,进口水产品中单增李斯特菌的危害风险性高于我国食品体系;(2)单增李斯特菌谱系Ⅲ具有极高的生物多样性,亚系ⅢA-3菌株为弱毒,可能由毒力调控因子PrfA的第145位氨基酸发生突变引起;(3)无害李斯特菌代表相对年轻的种,包含4个亚群,其中亚群A代表环境适应性的进化方向,亚群D与单增李斯特菌ⅢA-3构成单增李斯特菌-无害李斯特菌进化枝的进化中间体,该进化枝代表细菌致病力由强变弱的罕见案例:(4)GAD系统及ADI/AgDI系统与单增李斯特菌的抗酸应激相关,ADI/AgDI系统还与细菌致病力相关;(5)ADI代谢途径与AgDI代谢途径在ADI、双拷贝AgDI、OTC/PTC与AP等功能蛋白的介导下,并行不悖地发挥抗酸应激作用;(6)ADI系统受级联调控网络的调控。


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