收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

耐热、高活性杂合内切葡聚糖酶基因的设计、表达及酶学性质研究

周烈  
【摘要】: 热稳定性差和催化活性低是当前饲用内切葡聚糖酶生产和应用的瓶颈。本研究着眼于提高酶活较高基因的耐热性,以瘤胃真菌(Piromyces rhizinflata 2301)和耐热丝状真菌总状共头霉(Syncephalastrum racemosum BCC 18080)为亲本,将瘤胃真菌内切葡聚糖酶的高活性片段和总状共头霉内切葡聚糖酶的耐热片段进行拼接,设计出一种新的杂合内切葡聚糖酶基因,合成全基因后用大肠杆菌和家蚕BmNPV/Bac-to-Bac两种表达系统生产既耐热又在生理温度下酶活高的杂合内切葡聚糖酶,系统研究比较了杂合内切葡聚糖酶及其亲本酶的酶学性质。 1.里氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统中的探索性表达 采用RT-PCR方法克隆了里氏木霉QM9414内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因的cDNA编码序列(egl2),利用家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统,在细菌转座子的作用下将EGII基因整合到家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中,从而产生重组病毒。利用该重组病毒感染家蚕BmN培养细胞以及家蚕五龄幼虫,推算得出每只幼虫能够生产大约386μg重组内切葡聚糖酶,纯化蛋白的酶活约为352U/mg rEGⅡ。该重组酶蛋白的最适反应温度为55℃,最适pH为4.0。本试验结果表明,家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统可作为生物反应器生产具有生物活性的重组纤维素酶(如rEGⅡ),为杂合内切葡聚糖酶基因在家蚕生物反应器中的表达打下了实践基础。 2.杂合内切葡聚糖酶CelcdT'C'基因的分子设计及合成 瘤胃真菌P.rhizinflata羧甲基纤维素酶基因celA编码1个含有纤维素酶催化结构域Celcd的多肽。Celcd靠近N端是1个由28个氨基酸组成的连接肽,而C端则是一段仅由7个氨基酸组成的接合结构域,由这3部分组成的基因片段被命名为CelcdN'C'。除去CelcdN'C'靠近N端的连接肽(命名为CelcdC'),酶活没有发生很大改变,但其热稳定性急剧下降,证明N端连接肽具有稳定酶蛋白的作用。CelcdN'C'和CelcdC'对羧甲基纤维素的活性分别为344.9 U/mg和334.5 U/mg蛋白。研究证明,CelcdN'C'是带有一些外切葡聚糖酶活性但以内切葡聚糖酶活性为主的高活性瘤胃真菌纤维素酶,除去N端连接肽的那段区域CelcdC'为高酶活基因片段。 属于接合菌门的丝状真菌总状共头霉(S.racemosum BCC 18080)能够分泌耐热内切葡聚糖酶,最适反应温度为70℃,相对而言要高于接合菌门其它霉菌的内切葡聚糖酶。经过NCBI-BLASTP比对,确定BCC18080内切葡聚糖酶的纤维素结合域和连接区的序列为耐热基因T′片段。 委托南京金思特生物公司合成CelcdT'C'全基因,T′片段在N′端,CelcdC'在C′端,从而将CelcdC'以及T′基因片段成功拼接;同时考虑到后续实验,在N′端和C′端分别设计BamRI和HindⅢ酶切位点。CelcdT'C'全基因以EcoRV平端克隆方式克隆进pUC57-simple载体中,并冷冻保存待用。 3.杂合内切葡聚糖酶CelcdT'C'基因和亲本酶CelcdN'C'基因在大肠杆菌中的表达及纯化 采用亚克隆技术,以pET-30a(+)为表达载体,在E. coli BL21中表达了杂合内切葡聚糖酶CelcdT'C'基因和亲本酶CelcdN'C'基因,分别获得了阳性重组表达子BL21CelcdT'C'和BL21CelcdN'C'在对基因工程菌用IPTG诱导表达4 h后,菌液破碎离心取上清,点样于羧甲基纤维素钠平板上,50℃培养6 h,经过刚果红染色,在平板上可见明显的透明圈,说明表达产物EcelcdT'C'以及ECelcdN'C'都具有羧甲基纤维素酶活性;进一步用SDS-PAGE进行分析检测,EcelcdT'C'与ECelcdN'C'分子量分别约为61 kDa和54 kDa,与推导的融合蛋白分子量一致。 根据葡萄糖标准曲线计算得出,过柱纯化后重组CelcdT'C'和CelcdN'C'内切葡聚糖酶活性分别为11.12 U/ml和16.36 U/ml。它们的最适反应温度都为50℃,在动物生理温度范围内,亲本酶CelcdN'C'相对活性较高,在70℃以上高温,虽然杂合酶CelcdT'C'的酶活性要小于亲本酶CelcdN'C',但是较亲本酶表现出更强的耐热性;它们的最适反应pH都为5.0,其中杂合酶蛋白在小肠的中性环境中能表现出较高活性,而CelcdN'C'酶蛋白在弱酸性环境中的酶活性相对较高。 4.杂合内切葡聚糖酶CelcdT'C'基因和亲本酶CelcdN'C'基因在家蚕蛹中的表达及大鼠饲喂效果研究 利用家蚕BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统成功构建了含有CelcdT'C'和CelcdN'C'基因的重组病毒,并先后感染家蚕BmN培养细胞及家蚕蛹。Western blot分析鉴定结果表明,重组CelcdT'C'和CelcdN'C'酶蛋白在BmN细胞内成功表达,但上清中没有发现目的蛋白存在;在发病蚕蛹样品的上清粗酶液中,测得CelcdT'C'/CelcdN'C'的内切葡聚糖酶活性为463.4 U/mg CelcdT'C'和477.9 U/mgCelcdN'C',最适反应温度分别为60℃和50℃。 为了测定所表达酶的效果,用大鼠评定了饲喂效果。试验分4个组:基础日粮(负对照组)、基础日粮添加2.0%普通蚕蛹粉(正对照组)、添加2.0%表达了瘤胃真菌内切葡聚糖酶基因的蚕蛹粉(亲本酶组)和添加2.0%表达了杂合内切葡聚糖酶基因的蚕蛹粉(杂合酶组),按单因子实验设计完成。将感染110 h的家蚕蛹粉碎成粉,按设计比例配制大鼠日粮,进行为期27 d的饲喂试验。结果发现,在大鼠基础日粮中添加2.0%的蚕蛹粉不会影响饲料的适口性,添加蚕蛹粉各组大鼠的饲料营养成分消化率(干物质消化率、粗蛋白消化率和粗纤维消化率)显著高于对照组(P0.05),杂合酶组消化率高于亲本酶组,体重增加有较高趋势。 综上所述,本研究设计的耐热、高活性的杂合内切葡聚糖酶CelcdT'C'基因能在BmNPV/Bac-to-Bac快速基因表达系统中有效生产,蛋白分子的空间结构得以维持,而且表达产物具有一定的热稳定性及较高的催化性能,经过高温制粒后,较其亲本酶CelcdN'C'具有较高的纤维素酶活性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 冯雁,邢辉,曹淑桂,程玉华;两亲分子解除乙醇对内切葡聚糖酶的抑制作用[J];中国生物化学与分子生物学报;1994年03期
2 阎伯旭,曲音波,高培基,孙迎庆;色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用[J];中国生物化学与分子生物学报;1998年02期
3 熊鹏钧,文建军;交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆[J];生物工程学报;2004年02期
4 冯雁,曹淑桂,丁忠田,程玉华;Tween 80解除乙醇对内切葡聚糖酶(Cx)的抑制作用[J];中国生物化学与分子生物学报;1991年06期
5 顿宝庆;曲小爽;郭明鸣;路明;李桂英;张保明;;桔青霉CR-2内切葡聚糖酶蛋白纯化研究初探[J];中国农业科技导报;2010年02期
6 李相前;邵蔚蓝;;极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究[J];南京师大学报(自然科学版);2006年03期
7 肖邡明,张义正;枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达[J];生物工程学报;1996年S1期
8 乔宇,毛爱军,何永志,刘伟丰,董志扬;里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J];菌物学报;2004年03期
9 李相前;邵蔚蓝;;降解结晶纤维素极耐热葡聚糖酶重组菌的构建[J];南京林业大学学报(自然科学版);2006年03期
10 吴振芳;唐自钟;陈惠;韩学易;赖欣;吴琦;;毕赤酵母中植酸酶和内切葡聚糖酶共表达菌株的构建及其高效表达(英文)[J];生物工程学报;2010年05期
11 李相前;邵蔚蓝;;极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的高效表达[J];食品与发酵工业;2006年02期
12 韩学易;陈惠;胥兵;阮景军;;纤维素酶基因工程菌pHBM-End培养条件的研究[J];中国饲料;2008年17期
13 蔡曼;胡松楠;职晓阳;唐蜀昆;李文均;;新疆艾丁湖嗜盐放线菌纤维素酶特性初探[J];云南大学学报(自然科学版);2007年S3期
14 李相前;邵蔚蓝;;海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析[J];微生物学报;2006年05期
15 关苑君;陆秉政;冯启理;郑思春;;家白蚁中肠具有内切葡聚糖酶活性菌株的分离和鉴定(英文)[J];环境昆虫学报;2010年03期
16 张亚波;刘连盟;徐荣燕;李多川;;嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶I基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质[J];应用与环境生物学报;2009年03期
17 刘利;段承杰;封毅;唐纪良;冯家勋;;融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析[J];基因组学与应用生物学;2009年04期
18 程旺开;;金属离子对纤维素酶活性影响的研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年03期
19 程旺开;;金属离子对纤维素酶活性影响的研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年05期
20 黄艳;凌敏;覃拥灵;梁智群;;康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达[J];生物技术;2008年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王玉娟;王军;余增亮;;枯草芽孢杆菌JA18内切葡聚糖酶催化域的圆二色和荧光光谱研究[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年
2 刘海英;舒正玉;吴松刚;黄建忠;;长梗木霉内切葡聚糖酶基因的克隆与表达研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
3 魏艳丽;黄玉杰;扈进冬;李纪顺;杨合同;;具有生防活性巨大芽孢杆菌的分离及其功能基因克隆[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年
4 周烈;吴小锋;刘建新;;家蚕生物反应器生产重组里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ及其生物活性分析[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
5 陶毅明;安刚;龙敏南;陈清西;;曲霉Aspergillus glaucus内切葡聚糖酶的分离纯化及其性质的研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
6 王秋立;倪金凤;申玉龙;;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii β-D-内切葡聚糖酶在毕氏酵母中的表达[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
7 彭焕;;马铃薯腐烂茎线虫β-1,4内切葡聚糖酶基因(Dd-eng-2)cDNA全长的克隆与原核表达分析[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年
8 潘敏慧;吕军;鲁成;;BmNPV的双基因干涉对病毒增殖的影响[A];中国蚕学会第八届暨国家蚕桑产业技术体系家(柞)蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2011年
9 李文学;青学刚;刘俊凤;刘刚;肖金树;徐安英;;家蚕品种871C×872C对BmNPV抗性鉴定研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
10 崔颖俊;吴立娜;赵巧玲;裘智勇;沈兴家;唐顺明;郭锡杰;;家蚕幼虫感染BmNPV后血淋巴蛋白质组学分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周烈;耐热、高活性杂合内切葡聚糖酶基因的设计、表达及酶学性质研究[D];浙江大学;2010年
2 龙海波;小麦禾谷孢囊线虫β-1,4-内切葡聚糖酶和细胞壁扩展蛋白基因的克隆及功能分析[D];中国农业科学院;2012年
3 李兴华;纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究[D];浙江大学;2011年
4 王秀娟;嗜热真菌纤维二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和内切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造[D];山东农业大学;2011年
5 张亚波;嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造[D];山东农业大学;2009年
6 林凌;产纤维素酶菌株的筛选和枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶催化活性的改造[D];华中农业大学;2009年
7 李亚玲;嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达[D];山东农业大学;2007年
8 王希国;梅林青霉对纤维素降解特性及机制的研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
9 王淑云;纤维堆囊菌So9733-1纤维素酶复合体的蛋白质组学分析与酶基因的克隆、表征[D];山东大学;2011年
10 封毅;兔子盲肠未培养微生物纤维素酶基因的克隆、表达及产物的酶学特性研究[D];广西大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 秦伟;Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的表达研究[D];内蒙古农业大学;2011年
2 常磊;中国牦牛瘤胃微生物来源的双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶的克隆及功能研究[D];复旦大学;2010年
3 王丽丽;海栖热袍杆菌内切葡聚糖酶的定向进化[D];南京林业大学;2010年
4 黄玉杰;几丁质酶和内切葡聚糖酶编码基因的克隆及重组芽孢杆菌的构建[D];山东农业大学;2003年
5 谭静利;热纤梭菌纤维素内切葡聚糖酶在酿酒酵母细胞表面上的展示及其性质研究[D];曲阜师范大学;2012年
6 倪浩;黑曲霉内、外切葡聚糖酶基因的克隆与表达[D];南京林业大学;2010年
7 肖舸;绿色木霉的筛选与产纤维素酶发酵条件优化及部分酶学性质研究[D];四川大学;2004年
8 廖俊华;优化设计的内切葡聚糖酶基因Ends在毕赤巴斯德酵母中的表达研究[D];四川农业大学;2010年
9 熊鹏钧;低温纤维素酶基因的克隆、表达和产淀粉酶嗜热菌的筛选及基因克隆[D];国家海洋局第三海洋研究所;2004年
10 苏贝;海洋细菌Cellulophaga sp. QY201的内切葡聚糖酶研究[D];中国海洋大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 副研究员 陈薇;开发“分子生物”[N];科技日报;2001年
2 记者 毛黎;美首次观察到基因转录过程[N];科技日报;2011年
3 何国庆 张灏;在酶制剂生产中的应用(下)[N];中国食品报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978