收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于IBDV为模型的dsRNA病毒反向遗传学研究

魏永伟  
【摘要】: RNA病毒反向遗传学的发展极大地推动了RNA病毒的分子生物学研究和新型疫苗的开发。dsRNA病毒宿主范围广泛,对人或动物造成了重大危害和经济损失。但其反向遗传学的发展则远远落后于正链或负链RNA病毒。本研究以双RNA病毒科的传染性法氏囊病病毒(IBDV)为模式病毒,就dsRNA病毒的反向遗传进行探索性研究。 首先克隆了IBDV ZJ2000株基因组B节段全长cDNA,ZJ2000株基因组B节段全长为2827bp,在GenBank登录号为DQ166818。ZJ2000株和TL2004株的体内、体外生物实验表明ZJ2000和TL2004株原代病毒均能直接适应CEF细胞,并引起明显的细胞病变,ZJ2000株在CEF细胞上的复制速度明显慢于弱毒株JDl株和HZ2株,TL2004株对9-11胚龄的SPF鸡胚和SPF鸡均有较强的致病性。对GenBank数据库中双RNA病毒进行生物信息学分析,在国内外首次发现双RNA病毒科中IBDV和IPNV各自的基因组重配现象,并在国内外首次提出双RNA病毒基因组重配模型。IBDV基因组重配毒株说明IBDV的毒力除VP2外,多重因素可以影响IBDV的毒力,尤其是B节段在决定毒力方面扮演着重要角色。 以IBDV为模型,应用重叠PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,分别克隆到PCI真核表达载体当中,构建真核载体PCI-ma和PCI-mb,建立并联式共转染的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。继而应用红色和绿色报告基因构建串连式表达载体,该载体含两个独立的转录单位,结果显示报告基因串连式载体在同一靶细胞内的共表达情况明显优于两报告基因共转染在同一细胞内的表达效率。将IBDV基因组A、B节段以串连的方式构建到同一载体当中,该载体含两个独立的转录单位,载体命名为PCI-mab。将PCI-mab转染细胞进行病毒拯救,其拯救效率比并联式拯救效率提高100倍。 以IBDV为模型,应用PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,构建T7启动子控制下的IBDV感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3预先感染1h的Vero细胞,建立了基于辅助病毒表达T7 RNA聚合酶的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。 以IBDV为模型,成功实现了不依赖辅助病毒、借助表达T7 RNA聚合酶的细胞系的dsRNA病毒的遗传拯救。分别从原核表达菌株BL21工程菌基因组和痘病毒VTF7-3基因组中克隆T7 RNA聚合酶基因,结果显示克隆的基因同源性为100%。将T7 RNA聚合酶基因构建到逆转录病毒载体pLPCX中,经包装细胞PT67包装后得到具有感染性而不具有自我复制功能的假病毒颗粒JVT7,再将假病毒颗粒JVT7感染Vero细胞,经嘌呤霉素筛杀,建立了表达T7 RNA聚合酶的细胞系V-T7,并用此细胞系实现了IBDV的遗传拯救。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 韩榕,王勋陵,岳明;He-Ne激光对小麦RNA及可溶性蛋白合成的影响[J];山西师范大学学报(自然科学版);2001年03期
2 汪渊,储兵,陈厚早,张素梅,卜丽佳,朱华庆,周青,桂淑玉;真核细胞中总RNA的制备[J];安徽医科大学学报;2004年02期
3 胡成进,杨道理,舒冠双;一种快速提取真核细胞总RNA的方法[J];陕西医学检验;1997年02期
4 刘定干;同时抽提DNA和RNA的简便方法[J];生命的化学;1998年02期
5 朱迅,杨贵贞;同一细胞DNA和RNA同时分别提取的简便方法[J];吉林大学学报(医学版);1991年01期
6 侯俊,何红霞,貌盼勇,洪世雯,杨松涛,付体权;HCV特异性IgM抗体与HCV RNA及其与肝病活动的相关性研究[J];军事医学科学院院刊;2000年03期
7 徐建平,李保仝,胡毓安,黄宇烽;精液中丙型肝炎病毒的研究[J];中华男科学;2000年04期
8 裴东,谷瑞升;几种提取木本植物中RNA方法的比较和改进[J];植物生理学通讯;2002年04期
9 潘源,郝希山;RNA转染树突状细胞肿瘤疫苗研究进展[J];国外医学.肿瘤学分册;2004年05期
10 王保业;浅谈线粒体的自主性[J];河南教育学院学报(自然科学版);1997年03期
11 张丕奇,郑稚莺;9203菌株RNA对蕃茄花叶病(TM)的防治作用[J];生物技术;1997年01期
12 李明春,王俊琦,邢来君;一种快速、有效提取丝状真菌总RNA的方法[J];吉林农业大学学报;1998年S1期
13 卢一凡,邓继先,黄培堂,田靫;修正RNA的错误剪接提高转基因表达水平[J];科学通报;1998年22期
14 傅烈振,朱燕,王宁,潘滋书,张楚瑜;应用反转录 - 聚合酶链技术快速检测猪瘟病毒RNA的研究[J];中国兽医科技;1998年06期
15 张建伟,董以爱,曲华玲;冠状病毒的致病性研究概况[J];家畜生态;2004年02期
16 杨耿洁,刘思忠,李志义,丁进芳,詹玉田;脑脊液中免疫活性细胞及单核吞噬细胞RNA分布的研究[J];甘肃科学学报;1993年03期
17 王燕妮,孙万邦,金丽娟,付红,谢毅;真核细胞RNA的提取和mRNA纯化方法探讨[J];遵义医学院学报;1997年01期
18 林珏龙,陈耀文,李玫,张少英;分裂细胞的共聚焦显微镜观察[J];中国体视学与图像分析;1998年03期
19 刘兰英,顾军,汤建,马涧泉;人类心脏发育相关基因的初步筛选[J];中国病理生理杂志;1999年09期
20 卢一凡,刘广田;小麦HMW-GS1D×5基因时间特异性表达的研究[J];生物技术通报;1998年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 岳洋;朱化彬;郝海生;杜卫华;赵学明;王栋;;牛精子总RNA制备及mRNA线性扩增的初步研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
2 李士泽;赵雅楠;李玉恒;杨焕民;;冷诱导RNA结合蛋白的结构与功能[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
3 王洁;刘金亮;阴筱;高瑞;李向东;刘焕庭;;HC-Pro三个参与抑制RNA沉默氨基酸位点的鉴定[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 康磊;王荣福;闫平;;放射性标记对小干扰RNA在体内分布的无创性示踪研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
5 王峰;张秋平;陈金湘;;棉花总RNA的快速提取方法[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年
6 赵庆华;田纪伟;王雷;董双海;王震;刘诚袆;;RNA干扰环氧化酶2对人腰椎退变终板软骨细胞生长增殖及凋亡的影响[A];第十九届中国康协肢残康复学术年会论文选集[C];2010年
7 孙凯;汪谦;;液相芯片技术在小分子RNA检测分析中的应用[A];肝脏病防治学术研讨会及新进展学习班专刊[C];2005年
8 张晖;覃君慧;柳金雄;冯亚玫;陈秋生;;Sox2 RNA探针的制备及其mRNA在早期鸡胚中的原位杂交检测[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
9 孔瑞瑞;;hALP,一个新的t-UTP,通过结合并乙酰化UBF促进RNA Pol I的转录[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
10 吴修胤;张雪;张风河;;微小RNA与口腔肿瘤的研究进展[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 魏永伟;基于IBDV为模型的dsRNA病毒反向遗传学研究[D];浙江大学;2009年
2 于丽;纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因治疗大肠癌的实验研究[D];中南大学;2009年
3 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年
4 马进;水稻条纹病毒(RSV)RNA3、RNA4的克隆与抗RSV转基因水稻的培育[D];山东农业大学;2011年
5 金哲秀;RNA干扰抑制基质金属蛋白酶对小鼠动脉粥样硬化影响的实验研究[D];吉林大学;2011年
6 李建华;髓样细胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究[D];复旦大学;2010年
7 孙永刚;核干细胞因子RNA干扰对HT29细胞CDX2表达的影响[D];第三军医大学;2009年
8 刘爱军;脑内冷诱导RNA结合蛋白的表达及其神经保护作用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
9 靳宇;RNA带扭结结构的组合研究[D];南开大学;2010年
10 鄂继福;应用RNA干扰技术沉默Med-19基因及其对大肠癌细胞增殖影响研究[D];第二军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李喜英;黄瓜花叶病毒2b蛋白在RNA沉默通路中的作用方式研究[D];浙江理工大学;2010年
2 王冕;棉花RNA依赖的RNA聚合酶6(GhRDR6)基因的分离及功能分析[D];山东农业大学;2011年
3 王庆晓;RNA干扰逆转HeLaB2/DDP细胞顺铂耐药的研究[D];南京大学;2011年
4 石杜娟;利用RNA干扰技术抑制日本血吸虫酪氨酸羟化酶的合成[D];安徽医科大学;2011年
5 张旭;表达猪let-7c细胞株的建立及其对猪瘟病毒的调控作用[D];西北农林科技大学;2010年
6 王少军;RNA解旋酶p68在创伤愈合中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2010年
7 丁艳杰;葡萄病毒A MP基因RNA干扰载体的构建及其鉴定[D];中国农业科学院;2011年
8 崔广迪;基于H1N1的RNA二级结构的相似性比较研究[D];吉林大学;2010年
9 孟益聪;哺乳动物细胞有丝分裂中期染色体上RNA成分的研究[D];兰州大学;2010年
10 杨娟;非编码RNA片段化方法的建立及验证[D];浙江理工大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 常丽君;新技术让研究进入单细胞内RNA的世界[N];科技日报;2011年
2 聂翠蓉;RNA:纵是配角也精彩[N];科技日报;2009年
3 伊瑶;RNA干扰技术成明日黄花?[N];医药经济报;2011年
4 王小龙;科学家发现控制个体稳定的RNA片段[N];科技日报;2009年
5 本报记者 衣晓峰 聂松义 通讯员 陈英云;微小RNA揭开心律失常之谜的“金钥匙”[N];健康报;2010年
6 冯卫东;RNA干扰机制首次在人体中获得证实[N];科技日报;2010年
7 记者 常丽君;新RNA转录变体可简化生物线路[N];科技日报;2011年
8 记者 聂翠蓉;细胞“垃圾”也能变废为宝[N];科技日报;2008年
9 记者 刘海英;病毒会利用微RNA对人体实施攻击[N];科技日报;2010年
10 陈蕾;赛默飞世尔启动RNA干扰研究/药物筛选资助项目[N];中国包装报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978