收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

家蚕新型高效杆状病毒表达系统的开发和应用研究

曹翠平  
【摘要】: 昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,简称BEVS)是利用携带有外源目的基因的重组昆虫杆状病毒作载体在昆虫体内或昆虫培养细胞进行表达生产的一个重组蛋白生产系统。由于该系统所需要的周期远比动物或植物系统短,可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产,生产的重组蛋白产量高,蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善,而且由于昆虫杆状病毒具有限制性的宿主范围,只对特定种属的昆虫及其细胞进行感染,对人畜等脊椎动物没有感染能力,因此具有比在哺乳动物及其培养细胞生产系统更为安全等优点而成为目前最有效的真核表达系统之一。 目前昆虫杆状病毒表达系统因使用的病毒载体不同,主要可以分为两类,一类以苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus,简写为AcMNPV)作为表达载体;另一类以家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,简写为BmNPV)作为表达载体。AcMNPV表达载体系统已经发展比较成熟,在欧美国家应用较多。与之不同,家蚕BmNPV由于可以用家蚕幼虫或蛹作为载体进行大规模的基因表达,蛋白质翻译后加工修饰完善,生产成本较低。特别在我国,家蚕是一种非常重要的特色经济资源昆虫,饲养技术非常成熟,在将来的基因工程产业化方面已显示出广阔的应用前景。 然而,家蚕BmNPV杆状病毒表达系统在技术上还存在许多欠缺,特别在进行大规模产业化开发方面还有一些技术瓶颈问题迫切需要解决,主要有以下几个方面:(1)重组病毒的构建过程繁琐,花费时间长。传统的重组BmNPV的构建和筛选方法还依赖于培养细胞内的基因同源重组和空斑分析,需要非常熟练的技巧,而且花费时间较长,通常需要2-3个月:(2)重组蛋白产物在后期常被降解,生产效率降低。杆状病毒表达系统是一个裂解性的系统,杆状病毒本身具有多个蛋白酶基因,在表达目的基因产物的同时,这些蛋白酶也得到了表达。特别是在感染晚期,重组蛋白易受蛋白酶降解,而感染的家蚕体内的蛋白质降解问题尤其严重;(3)目前感染接种采用的经皮接种技术,效率低下。为了达到较高的表达水平,目前构建重组病毒通常将目的基因替换多角体基因,从而形成不产生多角体的芽生型“裸露”重组病毒。重组病毒经口感染效率很低,因此常采用皮下注射感染的方法,不仅工效低,而且容易产生污染。 针对上述问题,本研究通过现代分子生物学技术和手段,借鉴国外经验,对家蚕杆状病毒表达系统进行了有力改造,使之成为一个更加高效的、能够适合产业化生产的表达系统。主要研究成果如下:[1]构建了适用于家蚕的BmNPV Bac-to-Bac/Bacmid快速高效表达系统。借鉴国外业已开发成功的AcMNPVBac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZa肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacmid;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子,和细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmNPV病毒的构建。同时,对配套供体质粒进行了改造,构建带有分泌信号的供体质粒pBacGP67。[2]构建了能够表达多角体的重组BmNPV杆状病毒表达系统。将polh基因插入到p10位点,使用p10启动子控制多角体蛋白的表达。将筛选得到的p10被polh替换的Bmbacmid (polh+) DNA和helper质粒先后转化入DH10β,做成感受态细胞,得到同时含有Bmbacmid (polh+)和helper的DH10β,命名为DH10BmBac(polh+),结合上面构建的分泌型供体质粒,即构建成BmNPV Bac-to-Bac(polh+)快速基因表达系统。[3]删除了BmNPV杆状病毒自身的一种主要的蛋白酶基因,有效提高了表达效率。对杆状病毒基因组中引起蛋白降解的主要基因,半胱氨酸蛋白酶基因(CP),进行了基因敲除。同时,为了充分发挥本实验室构建的HyNPV病毒的优势,我们将Bac-to-Bac系统中的关键的8.6 kb片段按照BmNPV Bac-to-Bac快速表达系统的构建方法构建了HyNPV Bac-to-Bac快速表达系统。 本研究意义在于:(1)适用于家蚕BmNPV Bac-to-Bac快速系统的构建,在理论上突破了家蚕BmNPV表达系统中传统的重组病毒必须在昆虫细胞或昆虫活体内产生的思路,利用细菌转座子的位点特异性转座作用原理,在细菌内即可完成家蚕BmNPV重组病毒的构建,不仅在技术上有创新,而且丰富了家蚕杆状病毒表达系统的理论;在应用上提供了一个全新的技术平台,由于本研究建立的技术具有快速简便这一突出优点,很好地解决了目前家蚕杆状病毒表达系统应用中存在的技术繁琐、花费时间长这一长期困扰的关键问题,因此具有很好的应用前景。(2) BmNPV Bac-to-Bac (polh+)表达系统的构建,使重组病毒表型从芽生型病毒变为多角体病毒,该重组病毒能够经口接种家蚕,有效解决了一直困扰家蚕表达系统大规模应用中的重组病毒必须经皮接种这一瓶颈问题。(3)构建的HyNPV Bac-to-Bac(CP-)系统,较好解决了重组产物后期受蛋白酶降解的问题,有效提高了家蚕表达系统重组蛋白的生产效率。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 于峰;朱姗颖;李兵;沈卫德;王文兵;;能产生多角体的可线性化杆状病毒的构建[J];中国农业科学;2008年11期
2 邓继先,王少飞,杨琴,程萱,李琳;用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素[J];生物工程学报;1995年02期
3 邓继先,王少飞,杨琴,卢建申,程萱,李琳,周耐明,肖成祖;用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素[J];生物技术通讯;1994年03期
4 李继昌,童光志,仇华吉,周艳君,王玫,刘忠贵;表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建[J];东北农业大学学报;2003年04期
5 鞠会艳;夏咸柱;高玉伟;杨松涛;邹啸环;黄耕;李彦舫;;犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达[J];中国病毒学(英文版);2006年04期
6 鞠会艳;夏咸柱;高玉伟;杨松涛;邹啸环;黄耕;李彦舫;;犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达[J];畜牧市场;2009年09期
7 尹文玲;尹龙勃;叶伟成;孙学强;姚火春;张淼涛;王一成;张存;;猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J];病毒学报;2010年04期
8 王先炜;姜平;李玉峰;蒋文明;汤景元;;猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[J];中国病毒学(英文版);2006年01期
9 邱亚峰;葛菲菲;张雪莲;陈溥言;;表达GFP基因的马立克氏病病毒(MDV)转移载体的构建及初步应用[J];中国生物工程杂志;2006年05期
10 刘红梅;秦爱建;叶建强;陈鸿军;邵红霞;金文杰;刘岳龙;;表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建[J];中国病毒学(英文版);2006年03期
11 张静;葛晶;尹隽;钟江;;人甲胎蛋白增强子和鸡HS-4绝缘子对杆状病毒基因表达的影响[J];复旦学报(自然科学版);2007年03期
12 陈瑾;田志军;彭金美;王瑜;周艳君;安同庆;童光志;;表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J];中国预防兽医学报;2009年01期
13 王先炜;姜平;李玉峰;蒋文明;汤景元;;猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[J];畜牧市场;2009年08期
14 陈瑞爱;邵定勇;韩静芳;;猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性[J];中国兽医学报;2010年05期
15 周井祥;薛江东;刘晔;张守峰;朱霞;扈荣良;;表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建及鉴定[J];中国预防兽医学报;2010年12期
16 齐义鹏,黄永秀,孙爱珍;昆虫杆状病毒多角体基因在原核细胞中的表达[J];病毒学报;1989年02期
17 李萍萍;含狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒(RTTVV-3)传代后生物学特性研究[J];华中师范大学学报(自然科学版);1993年04期
18 余为宽,申庆祥,李大金,周清平,沈卫英,王健;人绒毛膜促性腺激素β亚基和补体C3d片段组成的单链多肽的生物合成[J];实验生物学报;1999年01期
19 张秀芹;夏咸柱;卫广森;常惠芸;高玉伟;;亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建[J];中国兽医科学;2006年02期
20 姚艳;张桂红;刘文军;陈铁桥;孙蕾;罗浑金;;一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析[J];微生物学报;2007年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭睿;刘卫星;潘中华;刘林;彭景琨;薛仁宇;曹广力;朱越雄;贡成良;;感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建[A];中国蚕学会商品性小蚕饲养规程和蚕病防控学术研讨会论文集[C];2010年
2 李文学;青学刚;刘俊凤;刘刚;肖金树;徐安英;;家蚕品种871C×872C对BmNPV抗性鉴定研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
3 庞义;;昆虫杆状病毒基因工程[A];杀虫微生物[C];1992年
4 吴小锋;龟井加惠子;高野良;原三郎;;介于AcNPV和BmNPV间的杂交重组病毒的构建和改进[A];中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛——蚕桑分论坛论文集(上册)[C];2001年
5 崔颖俊;吴立娜;赵巧玲;裘智勇;沈兴家;唐顺明;郭锡杰;;家蚕幼虫感染BmNPV后血淋巴蛋白质组学分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
6 潘敏慧;吕军;鲁成;;BmNPV的双基因干涉对病毒增殖的影响[A];中国蚕学会第八届暨国家蚕桑产业技术体系家(柞)蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2011年
7 叶秋霞;鲁银松;薛仁宇;曹广力;贡成良;;表达短Lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制BmNPV增殖研究[A];全国家蚕病害控制技术与安全养蚕模式学术研讨会论文集[C];2010年
8 朱莎;王文兵;李兵;沈卫德;;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因gp41及Da26的融合表达[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
9 曹翠平;何芳青;郭爱芹;相兴伟;陈琳;吴小锋;;利用家蚕BmNPV多角体晶体固定外源蛋白质的研究[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(2)[C];2009年
10 徐家萍;;家蚕对核型多角体病的抗性机制及安徽省蚕病防治的思考[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 曹翠平;家蚕新型高效杆状病毒表达系统的开发和应用研究[D];浙江大学;2007年
2 李兴华;纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究[D];浙江大学;2011年
3 蒋亮;基于转基因工程的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)抗性素材创新及抗性机制研究[D];西南大学;2013年
4 周阳;家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm5的基因分析及利用基因芯片筛选抗BmNPV相关基因[D];江苏大学;2010年
5 相兴伟;家蚕BmNPV ODV-E56/BmP95的生物学功能及多角体包埋外源蛋白的研究[D];浙江大学;2013年
6 岳万福;基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D];浙江大学;2009年
7 薛仁宇;表达dsRNA的转基因家蚕对BmNPV的抗性研究[D];苏州大学;2009年
8 郑浩;利用杆状病毒表达感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究[D];中国农业科学院;2009年
9 黄璐琳;病原微生物黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus)等诱导家蚕(Bombyx mori)全基因组寄主应答研究[D];西南大学;2010年
10 朱立成;纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究[D];浙江大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 冯娟;建立恢复重组BmNPV包涵体的拯救细胞系[D];河南农业大学;2010年
2 彭伟;昆虫杆状病毒液化家蚕宿主组织的机制研究[D];江苏科技大学;2012年
3 费伟强;复制缺陷型BmNPV载体的构建及初步应用研究[D];浙江理工大学;2013年
4 张晓丽;JAK/STAT途径对BmNPV的感染应答及家蚕作为痛风药物筛选动物模型的研究[D];苏州大学;2011年
5 周敬波;家蚕核型多角体病毒泰国株的鉴定及其bro基因家族分析[D];安徽农业大学;2012年
6 王婷婷;两株对BmNPV侵染差异的家蚕细胞系的全基因组表达谱分析[D];西南大学;2012年
7 倪爱民;家蚕核型多角体病毒多角体单克隆抗体的制备与鉴定[D];江苏大学;2010年
8 匡秀秀;家蚕核型多角体病毒BmNPV39k启动子的分析与改造[D];西南大学;2013年
9 成传刚;转基因干涉ie-2和lef-3基因对BmNPV体外增殖的影响[D];西南大学;2010年
10 李娜;抗BmNPV诱导型启动子转基因干涉载体的构建[D];西南大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王福海;中科院蚕研所蚕新品问世[N];中国纺织报;2008年
2 王福海;新蚕品种“野三元”试养成功[N];江苏农业科技报;2008年
3 童岱;DNA技术让蚕宝宝吐出彩丝[N];北京科技报;2007年
4 记者 华凌;转基因方法让蚕吃得少吐得多[N];科技日报;2011年
5 王福海;家蚕品种获农科院二等奖[N];中国纺织报;2007年
6 本报记者 刘松柏;基因治疗的探路者[N];经济日报;2010年
7 卢育辉通讯员 姚锡镇;广东桑树种质资源占全国近1/3[N];广东科技报;2007年
8 浙江省嘉兴市秀洲区农经局 李民;锐劲特悬浮剂对家蚕的残毒饲养试验[N];江苏农业科技报;2006年
9 军事医学科学院军事兽医研究所 海洋金宁一 陈晓月;禽流感疫苗的研究综述[N];中国畜牧兽医报;2008年
10 王福海 钱何英;一切为了蚕桑事业[N];中国纺织报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978