收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

营养因素对奶牛卵母细胞体外发育和克隆效率的影响

王争光  
【摘要】: 奶牛体细胞核移植技术在加速品种改良、结合转基因技术生产珍贵医用蛋白等方面有着广阔的应用前景。但目前克隆效率低、流产率高、后代存活率低和出生后代发育异常等成为该项技术广泛应用的瓶颈。导致这一瓶颈的因素很多,其中现有卵母细胞体外培养系统不能使卵母细胞,特别是卵胞质达到成熟和激活方法不能完全激活核移植后的重构胚是两个重要因素,这两个因素能引起核移植后核质互作出现异常,导致重构胚不能正确的实现重编程。因此,完善奶牛卵母细胞体外成熟培养系统,优化核移植后卵母细胞的激活方法,成为提高核移植效率的两个关键环节。 本研究依据现代细胞营养学理论,形成了一种无血清、化学成分明确的奶牛卵母细胞体外成熟培养液,并优化该培养液成熟培养的奶牛卵母细胞的激活条件。以体外培养的奶牛耳部成纤维细胞、输卵管上皮细胞及卵丘细胞为供体细胞,进行体细胞核移植证实了上述奶牛卵母细胞成熟培养液和激活方法的可行性。同时,研究绿茶多酚对IVF及NT植前胚胎体外发育的影响及机理,为提高核移植胚胎体外发育率提供理论依据。 1.奶牛核移植供体细胞系的建立 采用组织块贴壁法从奶牛耳部组织分离成纤维细胞,采用机械法分离奶牛输卵管上皮细胞,利用含血清的DMEM/F12培养液对两种细胞进行原代和续代培养;用胰蛋白酶消化液从卵泡中抽取的卵丘-卵母细胞复合物分离卵丘细胞,利用改良的McCoy's5a培养液进行原代和续代培养。传代纯化后分析三种细胞的形态特征、体外生长曲线和染色体核型,结果表明,三种细胞的形态正常、体外生长曲线符合正常细胞的一般规律、染色体核型正常,均可作为体细胞核移植的供体细胞。 2.无血清、化学成分明确的奶牛卵母细胞体外成熟培养液的优化 用PVP-40代替血清,建立了一种化学成分明确的卵母细胞体外成熟基础培养液(SOFaa-PVP-40),分别单独将不同浓度的葡萄糖(0 mM、1.5 mM、5.6 mM和20 mM)、IGF-I(0ng/mL、50 ng/mL、100ng/mL和150ng/mL)、GTPs(0μM、10μM、15μM和20μM)添加到基础培养液中,对奶牛卵母细胞进行IVM、IVF和IVC,以筛选三种物质适宜的添加浓度。结果表明,获得最高卵裂率和囊胚率的葡萄糖、IGF-I和GTPs添加浓度分别为5.6mM,100ng/mL、15μM。将三种物质以优化的浓度同时加入到基础培养液中,构建一种无血清、化学成分明确的优化培养液(Optimized SOFaa),以传统的TCM-199+ FBS培养液为对照,比较两组培养液培养后的卵母细胞体外成熟率、卵裂率、囊胚率及细胞内GSH含量。结果表明,所构建的卵母细胞优化培养液可以代替传统的TCM-199+FBS培养液用于奶牛卵母细胞的体外成熟培养,并提高了成熟后卵母细胞的囊胚发育率(39.2%vs.30.4%,P0.05)。卵母细胞发育能力的提高与细胞内GSH含量的增加有关(14.3 pmol/oocyte vs.8.9 pmol/oocyte, P0.05)。本研究的结果还证实,在秋季利用切剖法对卵巢表面直径为3-6 mm的卵泡采集卵母细胞,可以获得较好的卵母细胞数量、体外成熟率、体外受精后卵裂率及囊胚率。 3.奶牛卵母细胞激活条件的优化 通过比较不同处理对卵母细胞激活及孤雌胚发育的影响筛选奶牛卵母细胞的激活方法。奶牛卵母细胞在Optimized SOFaa培养液中成熟并脱去卵丘细胞后按照试验设计进行激活处理。以单一激活,成熟的卵母细胞用离子霉素(5μM,5min),乙醇(7%,7 min),钙离子载体A23187(5μM,5 min)或锶(10 mM,5h)单独激活试剂进行处理。离子霉素和乙醇处理组获得的原核形成率(39.4%,41.2%vs.21.3%,25.2%)和卵裂率(30.3%,28.1%vs.19.7%,23.7%)显著高与另外两组(P0.05)。以联合激活,用上述浓度的离子霉素和乙醇与6-二甲基氨基嘌呤(2.0 mM,3h)或放线菌酮(10μg/mL)+细胞松弛素B(7.5μg/mL,3h)联合处理卵母细胞。离子霉素+6-二甲基氨基嘌呤处理组和乙醇+放线菌酮+细胞松弛素B处理组卵母细胞获得的原核形成率(51.0%,53.4%vs.39.6%,35.3%)、卵裂率(41.3%,41.6%vs.28.1%,26.1%)及囊胚率(18.2%,19.3%vs.10.1%,11.1%)显著高于与其他组(P0.05)。以IVF胚胎为对照,对离子霉素+6-二甲基氨基嘌呤和乙醇+放线菌酮+细胞松弛素B激活获得的孤雌胚胎进行染色体倍性分析和凋亡检测。结果表明,与离子霉素+6-二甲基氨基嘌呤处理组相比,乙醇+放线菌酮+细胞松弛素B处理组获得了较低的单倍体率(7.4%vs.15.5%,P0.05)和细胞凋亡率(7.0%vs.9.1%,P0.05)。结果揭示,乙醇+放线菌酮+细胞松弛素B联合激活是更有效的奶牛卵母细胞激活方法。 4.优化的卵母细胞体外成熟培养液和激活方法在奶牛克隆技术中的应用 为了验证筛选的Optimized SOFaa卵母细胞体外成熟培养液和激活方法用于奶牛体细胞核移植的可行性,将奶牛卵母细胞分别培养于Optimized SOFaa培养液和传统培养液(TCM-199+FBS)中,成熟后分别以卵丘细胞为供核细胞进行核移植,比较两组重构胚的卵裂率及囊胚率,结果表明,Optimized SOFaa可用于核移植受体卵母细胞的成熟培养,并且用该培养液成熟的卵母细胞获得了比传统培养液成熟的卵母细胞更高的囊胚率(21.2%vs.14.3%,P0.05)。优化的激活策略也可以用于奶牛体细胞核移植。 以Optimized SOFaa培养液成熟的卵母细胞为受体,分别以成牛耳部成纤维细胞、输卵管上皮细胞及卵丘细胞为供体,进行核移植,结果表明,供体细胞类型能影响核移植的效率,以卵丘细胞为供体获得的囊胚率显著高于另外两种核供体(21.2% vs.15.9%,13.7%,P0.05),卵丘细胞更适合于作为奶牛体细胞核移植的供体细胞。分别用GO期卵丘细胞和正常生长的卵丘细胞为供体细胞进行了核移植,结果表明,核质互作能影响核移植的效率,GO期卵丘细胞为核供体获得了较高的囊胚率(21.2% vs.12.2%,P0.05)。 5.绿茶多酚对奶牛IVF和NT胚胎体外发育能力的影响及机理研究 IVF和NT胚胎外生产时由于必须在可见光和高于体内的氧气条件下操作,增加了胚胎细胞内活性氧(ROS)的产生。ROS对牛胚胎的毒害作用已经被广泛证实,绿茶多酚(GTPs)是绿茶叶中分离提纯的酚类化合物复合体,研究已经表明GTPs具有强的抗氧化活性,是有效的ROS(如O2-、H2O、OH和NO)清除剂。为了研究GTPs对奶牛卵母细胞体外受精和植前胚胎早期发育的影响。分别在卵母细胞体外受精期间和IVF及NT胚胎培养期间向培养液中加入不同浓度的(0,10,15,20,25μM) GTPs,结果表明,在IVF培养液中添加不同浓度的GTPs均不能提高卵裂率及囊胚率;与对照组相比,添加15μM GTPs到IVF胚胎培养液中显著提高了囊胚率(33.6%vs.24.8%,P0.05),但更高浓度GTPs(20或25μM)的添加并没有进一步增加囊胚率(21.1%,19.0 vs.24.8%)。同样在NT胚胎体外培养液中添加15μM GTPs也提高了囊胚率(25.1% vs.19.0%)。本研究还进一步证实,培养在含15μM GTPs中的IVF胚胎和NT胚胎早期发育能力的增强与其细胞内GSH含量增加有关。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 薛冰;张兴会;宋先忱;薛会杰;;JIVET技术在绒山羊新品系选育中的应用[J];现代畜牧兽医;2011年06期
2 林雍峰;张勇;李鸿岩;胡俊杰;赵兴绪;;绵羊卵母细胞蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析[J];安徽农业科学;2011年16期
3 邓明捷;赵琎;杨明洁;张田;王敏康;;芸豆凝集素受体在小鼠生殖细胞上的分布及作用研究[J];安徽农业科学;2011年18期
4 刘晓辉;曹阳;郎洪彦;金海国;罗晓彤;刘铮;王晓阳;;培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响[J];安徽农业科学;2011年20期
5 袁慧敏;张旭成;王贺;高璐;方南洙;李钟淑;李福俊;;黑熊-牛异种重构胚最佳供体的研究[J];江苏农业科学;2011年03期
6 王晓明;崔成哲;具龙哲;孙成春;白红女;金一;;半胱氨酸对猪卵母细胞体外发育潜力及谷胱甘肽水平的影响[J];畜牧与兽医;2011年04期
7 汪立芹;王静;金贤华;陈博;黄俊成;;PDE3与亮甲酚蓝在绵羊卵母细胞体外培养中的应用研究(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年07期
8 孔庆然;朱江;黄波;郇延军;王峰;石永乾;刘仲凤;武美玲;刘忠华;;TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达[J];遗传;2011年07期
9 章寒琼;张西锋;潘博;沈伟;李兰;;BPA不影响卵母细胞减数分裂相关基因Dazl的甲基化[J];青岛农业大学学报(自然科学版);2011年02期
10 周婧;唐元凤;曲洪磊;何宇乾;宋学雄;;金黄地鼠超排后未排卵泡卵母细胞的成熟度和受精能力的观察[J];青岛农业大学学报(自然科学版);2011年02期
11 郑旭;郭丹;张兴会;王春艳;豆兴堂;宋先忱;;绒山羊羔羊超数排卵的影响因素研究[J];当代畜牧;2011年05期
12 郑旭;郭丹;张兴会;王春艳;豆兴堂;宋先忱;;影响幼龄辽宁绒山羊超数排卵效果因素的研究[J];现代畜牧兽医;2011年06期
13 梁鑫;单旭东;蒋小辉;漆著;孟衍建;;完整顶体精子注入卵细胞后对胚胎发育的影响[J];四川农业大学学报;2011年02期
14 魏杰;聂竹兰;李杰;刘宇;艾则孜;魏新明;;塔里木裂腹鱼性腺形态学与组织学的研究[J];大连海洋大学学报;2011年03期
15 于天飞;徐兴军;杨晓杰;吕建伟;于晶;张军;;动物胚胎工程研究进展[J];生物学教学;2011年08期
16 刘娣琴;张进隆;;BMP-15基因研究进展[J];畜牧兽医科技信息;2011年08期
17 李继连;王丽;胡满;;哺乳动物体细胞克隆技术应用的研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年06期
18 章美玲;张运海;陶勇;刘亚;曹鸿国;李运生;Oto Hanus;Josef Kucera;章孝荣;;供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响[J];农业生物技术学报;2011年04期
19 赵芳;肖雄;李跃民;赵海龙;邓玉金;马腾;;维生素E和半胱氨酸对昆明系小白鼠体外受精胚胎发育的影响[J];黑龙江畜牧兽医;2011年13期
20 江文波;赵冬梅;胡炜;赵浩斌;;斑马鱼Zar1和Zar1-like基因的克隆及其表达分析[J];水生生物学报;2011年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘志涛;田树军;陈晓勇;张艳普;胡媛媛;温兵强;;幼畜卵母细胞体外发育能力研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
2 许丹宁;田允波;黄运茂;陈学进;;山羊卵母细胞孤雌激活和孤雌胚体外发育研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
3 崔凯;李和平;齐艳萍;陈学进;;马鹿卵母细胞体外成熟培养初步研究[A];2010中国鹿业进展[C];2010年
4 杨小淦;刘红波;卢晟盛;陆阳清;卢克焕;;利用单胚胎抑制消减杂交技术筛选猪MⅡ期卵母细胞转录本的研究[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
5 陈秀芬;夏国良;谢辉蓉;陶勇;雷蕾;;促性腺激素诱导大、小鼠卵母细胞体外成熟的差异[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
6 张秋婷;梁洋;王春生;安铁洙;;玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞受精的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2006年
7 豆兴堂;;羊JIVET技术研究进展[A];《2011中国羊业进展》论文集[C];2011年
8 王超;夏国良;金世英;王凤超;雷蕾;;促减数分裂甾醇参与FSH诱导的小鼠卵母细胞的成熟[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
9 章保平;易建明;高国龙;;牛卵巢黄体类型对卵母细胞采集及体外成熟率的影响[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
10 闫真;马玉珍;刘东军;周平;旭日干;;间隙连接蛋白45基因的克隆及在绵羊卵母细胞COCs中的表达[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 鹿群;卵母细胞激活技术与胚胎干细胞分离、培养[D];山东大学;2005年
2 谢辉蓉;促减数分裂甾醇对小鼠卵母细胞减数分裂的作用研究[D];中国农业大学;2004年
3 武浩;小鼠-山羊交互异种核移植研究[D];西北农林科技大学;2004年
4 禹学礼;牛IVF胚胎培养与冷冻方法优化[D];西北农林科技大学;2010年
5 王慧利;小鼠卵母细胞染色质凝集的调控及咖啡因在山羊体细胞克隆中的应用[D];山东农业大学;2010年
6 王争光;营养因素对奶牛卵母细胞体外发育和克隆效率的影响[D];浙江大学;2007年
7 崔龙波;不同年龄小鼠生发泡互换及改变核质比对卵成熟和发育的影响[D];东北农业大学;2003年
8 聂睿;HBV在辅助生育技术中的传播风险[D];华中科技大学;2011年
9 白晓红;卵母细胞体外成熟培养的研究[D];天津医科大学;2002年
10 颜山;卵母细胞成熟潜能获得的温度依赖性分子机制的初步研究[D];复旦大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 麻柱;荷斯坦奶牛活体采卵与体外受精技术研究[D];河北农业大学;2006年
2 邢琼;雌性配子与人类三原核囊胚的玻璃化冷冻研究[D];安徽医科大学;2007年
3 潘登科;山头体细胞核移植(克隆)及胚胎移植的研究[D];甘肃农业大学;2002年
4 张艳玲;水牛精子胞质内显微受精的初步研究[D];广西大学;2002年
5 朱广香;屠宰山羊卵巢有腔卵母细胞体外培养成熟的研究[D];四川农业大学;2003年
6 路国正;波尔山羊耳成纤维细胞核移植的研究[D];山东师范大学;2003年
7 牛蕾;小鼠卵母细胞和小鼠核移植胚胎中高尔基体的作用探索[D];第四军医大学;2005年
8 许杰;山羊卵母细胞体外成熟培养、体外受精及受精卵培养研究[D];四川农业大学;2005年
9 石少权;小鼠卵母细胞体外成熟培养及体外受精研究[D];重庆医科大学;2004年
10 金海霞;不同培养介质及冷冻方法对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响[D];郑州大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 许琦敏;出生后卵母细胞还能不断产生[N];文汇报;2009年
2 记者 刘霞;雌性老鼠出生后仍产卵母细胞[N];科技日报;2009年
3 杨淑娟;美发现近期骨髓细胞不能形成卵母细胞[N];中国医药报;2006年
4 付东红 马凤琴;我国第一个“三冻”男婴诞生[N];健康报;2006年
5 张建松 杨金志;挑战80多年生殖“常识”[N];大众科技报;2009年
6 记者 何德功;日本用卵母细胞成功培育出幼鼠[N];新华每日电讯;2004年
7 孙玉良 姚永玲;国内首例“三冻”试管婴儿在北医三院诞生[N];光明日报;2006年
8 美讯;使用冷冻卵母细胞可能降低体外受精成功率[N];医药经济报;2006年
9 本报记者 吴洣麓;吴际:发现卵子再生秘密[N];北京科技报;2009年
10 记者  刘欢 通讯员  孙玉良 姚永玲;国内首例“三冻”试管婴儿诞生[N];北京日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978