重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸与发酵优化

【摘要】：3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物,可以被用来合成多种重要的化合物,具有十分广泛的应用前景。近些年伴随着生物柴油工业大量生产,甘油价格日渐下降。若能得到一株可以高效利用甘油催化生产3-HP的菌株,将会产生巨大的环境与经济效益。本论文为了实现利用重组克雷伯氏菌发酵合成3-HP,开展了以下研究。PCR扩增Cupriavidus necator Gab D4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因,分别与获得卡那霉素(Kanamycin)抗性的pUC19质粒(p UC19Kan)连接,导入宿主菌Klebsiella pneumoniae DSM2026。通过摇瓶发酵,比较重组菌KpKan/KGSADH与KpKan/Gab D4的发酵性能。结果证明,Kp Kan/KGSADH和KpKan/Gab D4的最高3-HP产量分别为3.66与2.56 g/L,最终选择产量较高的KpKan/KGSADH重组菌进行后续研究。通过摇瓶单因素实验,详细优化重组菌KpKan/KGSADH的底物浓度、酵母膏浓度、初始p H、装液量与接种量等影响因素。获得最优条件为:30 g/L甘油、4 g/L酵母膏、初始pH 7.0、2%接种量、250mL摇瓶装125 mL发酵培养基。优化后的3-HP的最高产量为3.81 g/L。在此基础上,摇瓶发酵过程中两次调节pH至7.0,3-HP的最高产量可达11.2 g/L。在5 L发酵罐中,运用上述优化的培养基配方,以分段调控p H的方式进行发酵,3-HP的产量最高达到11.9 g/L;采用实时调控pH的方式进行发酵,3-HP的产量最终到达13.4 g/L。最后,在实时调控pH的基础上,分别在发酵12 h与40 h补充60 g甘油,3-HP的产量最终达到本研究最高的15.1 g/L。本论文首次将C.necator GabD4的醛脱氢酶基因导入Klebsiella pneumoniae DSM2026构建重组菌。同时,详细对比了KpKan/KGSADH与KpKan/GabD4的产3-HP性能。通过摇瓶和5 L发酵罐的发酵优化,使Kp Kan/KGSADH的产3-HP水平达到15.1 g/L,为初始水平的4倍。通过本研究,为利用Klebsiella pneumoniae重组系统进一步提高3-HP产量奠定基础。