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二甲双胍调节自噬和焦亡发挥脑缺血再灌注损伤保护作用

袁钰萍  
【摘要】:近年,自噬(autophagy)和细胞焦亡(pyroptosis)在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)中的作用越来越受到人们的重视。二甲双胍(Metformin,Met)作为经典的降糖药,目前研究发现,它能降低脑缺血缺氧引起的神经损伤。但目前没有发现Met对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的直接作用机制。Met的经典作用是激活单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路,引起自噬的发生,Met抑制炎症反应是否通过这条通路发挥作用,还没有报道。本次课题就基于此思路,考察Met对CIRI大鼠脑组织的自噬和细胞焦亡两条通路的影响,以便更深入了解Met的作用机制,阐明其药理作用,为其临床应用提供理论支持。第一部分不同浓度二甲双胍对脑缺血再灌注损伤大鼠保护作用的研究。目的:探讨不同浓度Met对CIRI大鼠的影响。方法:本研究采用线栓法栓塞成年雄性SD大鼠大脑中动脉120 min后再灌注制备CIRI模型,90只大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、Model+Met 50,100和200 mg·kg~(-1)组,Model+EDA 10 mg·kg~(-1)组,每组15只,选取10只造模成功的大鼠进行试验。Met术前(口服灌胃i.g.)给药21 d,依达拉奉(edaravone,EDA)术前(腹腔注射i.p.)给药7 d。观察大鼠体质量和血糖、神经功能评分、水迷宫数据、脑梗死体积和病理切片指标。结果:不同浓度的Met预处理后,对血糖无影响,能够有效地改善神经行为学评分,可改善CIRI大鼠认知功能,减少CIRI大鼠的脑梗死体积,减轻脑组织海马CA1区域神经元的病理性损伤,且其中200 mg·kg~(-1)Met效果最好。结论:不同浓度Met预处理后能够起到脑保护作用,降低CIRI,选择200mg·kg~(-1)Met进行下面的实验。第二部分二甲双胍对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的自噬和焦亡两条通路的影响。目的:探讨Met对CIRI大鼠脑组织的自噬和焦亡两条通路的影响。方法:采用AMPK抑制剂Compound C(Cc)、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA)和Caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK(Z-YVAD)分别阻断p-AMPK、LC3-II和Caspase-1生成通路。采用135只大鼠随机分为Sham组、Model组、Model+Met200 mg·kg~(-1)组(i.g.)、Model+Cc 20 mg·kg~(-1)组(i.p.)、Model+Met+Cc组、Model+3-MA 200 mmol·L~(-1)组(侧脑室注射i.c.v 2μL)、Model+Met+3-MA组、Model+Z-YVAD 8μg·kg~(-1)·d~(-1)组(i.c.v 2μL)和Model+Met+Z-YVAD组,每组15只,选取10只造模成功的大鼠进行试验。Met术前给药21 d,Cc、3-MA和Z-YVAD-FMK于术前30 min给完药。观察大鼠神经功能评分、脑梗死体积、病理切片指标和相关蛋白的表达。结果:Met预处理后的CIRI大鼠p-AMPK表达增加,大鼠脑损伤减轻,用抑制剂Cc阻断AMPK后,Met的脑保护作用被阻断;Met可以增加LC3-II,降低p62的表达,用自噬抑制剂3-MA阻断自噬后,Met的LC3-II表达降低,p62表达增加,AMPK表达没有受影响,但Met的脑损伤保护作用被阻断;Met能降低NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、Caspase-1的表达,提示Met能抑制炎症小体产生。我们用Caspase-1特异性抑制剂Z-YVAD阻断Caspase-1的生成后,Model+Met组和Model+Met+Z-YVAD组的LC3-II表达增加,p62降低,Caspase-1表达降低,且Met+Z-YVAD的脑保护作用比单用Met更强。结论:Met的脑保护作用与激活AMPK通路有关,可能通过自噬去除损伤的线粒体,减少了受损线粒体引起的NLRP3炎症小体活化导致的细胞焦亡。第三部分在细胞层面上探究二甲双胍调控自噬和焦亡通路的具体机制。目的:为探究Met在细胞层面上调控自噬和焦亡通路的机制作用,同时探究Met对PC12细胞氧化应激水平的影响。方法:采用Cc、3-MA和Z-YVAD作用于H_2O_2诱导的PC12细胞损伤模型,探讨Met对损伤细胞的影响,观察细胞形态,测定MTT存活率、线粒体跨膜电位、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量以及与自噬、细胞焦亡相关蛋白的表达。结果:不同浓度H_2O_2处理过的细胞发生不同程度的损伤,线粒体跨膜电位逐渐下降,说明H_2O_2对PC12细胞的损伤可以降低线粒体跨膜电位。Met可改善损伤细胞的细胞形态,增加细胞存活率,升高线粒体跨膜电位,降低MDA的含量、升高SOD、GSH的含量,Western印迹法检测蛋白结果显示与实验二结果基本一致。结论:Met可降低H_2O_2诱导的PC12细胞氧化应激损伤,作用与激活AMPK通路有关,可通过自噬发挥作用,可降低NLRP3炎症小体表达,抑制了细胞焦亡的作用,与实验2相应证。


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