收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

二氯甲烷降解菌的分离鉴定、降解特性及关键酶基因克隆与表达研究

吴石金  
【摘要】: 本文通过选择性富集培养,从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌,并对所分离菌株进行生化鉴定以及16S rDNA系统发育研究,进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究,以期为探索微生物对异型生物质(Xenobiotics)的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。 本研究获得的主要结论如下: 1.从废水和活性污泥中分离筛选得到2株二氯甲烷降解菌株,分别命名为WZ-12和wh22菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验(Biolog)、全细胞脂肪酸分析、G+C mol%含量分析以及16S rDNA序列同源性分析,证明WZ-12和wh22菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中WZ-12菌株被鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的又一菌株;推测菌株wh22应当是梭形杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的又一菌株,首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。 2.WZ-12和wh22两株菌都有较宽的温度、pH及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的pH环境中,菌株对二氯甲烷的降解效率也最高;在30℃、初始pH6.0的MM培养基中,WZ-12菌株72 h对二氯甲烷的降解效率达85.23%。而wh22菌株在37℃、初始pH6.0的MM培养基中48 h的降解效率约80.09%。有机物的加入可使降解菌WZ-12对二氯甲烷的降解加速,其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22菌株的降解能力影响不大;WZ-12和wh22菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制,降解率下降,符合非线性的高姆比兹模型。菌株WZ-12能适应高盐浓度生长,NaCl浓度在10-60 g L~(-1)范围生长良好,对CH_2Cl_2、CH_2BrCl、C_2H_2Cl_2和C_2H_4Cl_2均有降解能力,72 h降解效率分别为78.28%、58.19%、60.32%和45.08%。 3.菌株wh22含有1个降解性质粒,分子量为48.8 kb,命名为pRC11。初步建立了质粒pRC11的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒,可在不同种属菌株之间转移,以E.coli DH5(dcm~-)作为受体菌做质粒的接合转移试验,阳性转化子的转化频率为1.65×10~5/μg of plasmid DNA。 4.通过设计基于二次多项式数学模型,对试验结果进行多元回归分析,得到了如下适用于DCM降解率预测的经验关联式回归模型: 采用响应面分析法,在摇瓶水平上,得到了菌株WZ-12生物降解工艺的最优条件为:DCM初始浓度380 mg/L(X_1)、葡萄糖添加浓度13.72 mg/L(X_2)、H_2O_2添加浓度115 mg/L(X_3)。在此条件下,预测得到的最大降解率为93.18%。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证,得到好氧降解率平均值为92.88±0.27%,与模型预测值(93.18%)吻合较好,该降解率回归模型为菌株WZ-12在生物法处理含DCM废气的应用有一定的指导意义。 5.对来自菌株WZ-12的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究,获得二氯甲烷脱卤素酶,纯酶分子量为31 kDa,比酶活提高了8.27倍,得率为34.83%,纯化倍数为8.27。该酶为诱导酶,最佳产酶温度为30℃,粗酶液在50℃以下具备一定的耐热性能和稳定性,最佳产酶pH为6.5;该酶在pH5-7之间稳定较好,但当pH大于7或小于5时,稳定性急剧下降。Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活有增强作用,而Cu~(2+)、Zn~(2+)和Ba~(2+)则抑制酶活性,Hg~(2+)对酶活性抑制影响最大。 该脱卤素酶表观Km值在30℃(pH7.0)为5.25×10~(-3)mol/L,Vmax为3.67×10~(-4)mol/L·min,K_(cat)为6.97×10~4S~(-1)。该酶的底物特异性不高,可以催化CH_2Cl_2、CH_2Br_2、CH_2I_2和CH_2BrCl脱卤。 6.从菌株WZ-12中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因dcmR,并对克隆产物进行了Southern杂交鉴定。dcmR编码基因序列为864 bp,编码脱卤素酶蛋白大小为288个氨基酸残基,预测分子量32±1 kDa。BLAST比对结果显示,克隆的基因片段与Methylobacterium sp.DM4的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6%。蛋白的氨基末端约20-80 aa与GST有类似的结构域,中间约第50位-80位aa间具有多个跟GSH的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用SEQUIN软件上传至GenBank,得到序列登录号FJ405230。 7.通过构建具T7强启动子的pET高效表达载体(pET21a和pET15b),转化E coli(DE3)RP,构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了3种表达载体,pET-21a-dcmR(no-tag)不含任何标签,其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活(21.95U·mL~(-1))高于原始菌株WZ-12(14.26U·mL~(-1)),可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究;pET-21a- dcmR with his-tag引入了6个组氨酸残基“标签”(His-tag),为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义;pET-15b-dcmRwith his-tag and LVPRGS thrombin在引入6个组氨酸残基“标签"(His-tag)的同时,增加了凝血酶酶切位点,方便了His-tag的切除。将3种原核表达载体转化E.coli(DE3)RP并诱导表达,得到了具有酶活性的融合蛋白。 8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经IPTG诱导后,细菌总蛋白表达量为0.76g/L,其中融合蛋白占总蛋白的32.00%,酶活最高达25.78U/mL,酶的比活为88.86 U/mg蛋白。重组菌周质中酶活2.92 U/mL,胞内酶活22.86 U/mL。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高1-2倍。利用融合蛋白N末端的His-tag,经金属螯合亲和层析纯化后,得到了纯度较高的融合酶蛋白,酶蛋白的得率为72%,比活为144.73 U/mg。凝血酶切除His-tag后,经SDS-PAGE测定,重组蛋白的分子量为33±1 kDa,与理论计算值34 kDa相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在pH 6.5,温度30℃有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和pH要敏感。最后,对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明,重组菌在LB培养基中的生长特性与原始菌株没有差别,生长至对数期A_(600nm)值都可达到2.4左右。重组菌株dcmR-1在25 h的降解率达90%以上,降解效率比原降解菌株有明显提高。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 庄庆丰;章晶晓;倪建国;陈东之;陈建孟;;二氯甲烷的生物降解技术进展[J];科技通报;2012年01期
2 王家德,陈建孟,于建明;二氯甲烷降解菌的分离及其特性[J];浙江工业大学学报;2002年01期
3 王家德,陈建孟,于建明;二氯甲烷降解菌的研究[J];中国环境科学;2001年06期
4 杨京霞;张志艳;徐智策;;二氯甲烷回收方法的研究进展[J];河北化工;2011年09期
5 王冬群;;二氯甲烷回收条件的优化[J];浙江农业科学;2010年06期
6 ;二氯甲烷[J];洗净技术;2003年10期
7 ;道化学增强氯甲烷实力[J];氯碱工业;2000年09期
8 ;氯甲烷生产及市场前景[J];河南化工;1999年09期
9 ;国外化工技术[J];陕西化工;1987年03期
10 马世鑫;二氯甲烷回收的新进展[J];感光材料;1988年03期
11 李奕良;;氯甲烷的液相氯化[J];天然气化工(C1化学与化工);1988年03期
12 王之德;氯化铵利用的新方向——制取氯甲烷和氨[J];化工进展;1988年03期
13 鹏;;以甲醇为原料制备二氯甲烷、氯仿联产四氯化碳[J];浙江化工;1988年06期
14 邓启元;缪以懋;张代洪;唐基德;徐存芳;;氯甲烷作业工人免疫状态及微核的观察[J];职业卫生与病伤;1988年02期
15 裴留成,苗健,娄振岭;用二氯甲烷代替氯仿生产胆红素的新工艺研究[J];沈阳药学院学报;1989年03期
16 康忠玉;;二氯甲烷作业工人的健康状况调查[J];职业卫生与病伤;1989年01期
17 王国兴;;二氯甲烷作业工人健康调查[J];化工劳动保护(工业卫生与职业病分册);1989年04期
18 高国文;易国芝;朱家香;;甲胺磷在二氯甲烷溶剂中稳定性研究结果初报[J];农药科学与管理;2007年03期
19 李淑芹;司玉荣;;淄博市淄川区二氯甲烷作业工人的健康状况调查[J];职业与健康;2007年17期
20 孙世栋;刘莉;;废二氯甲烷回收工艺的研究[J];环境科学与管理;2006年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张艳利;杨威强;吕素君;张洲;Jianzhen Yu;王新明;;大气氯甲烷浓度、排放和时空分布特征研究[A];2017中国地球科学联合学术年会论文集(五十一)——专题106:环境地球化学、专题107:地球科学社会责任、专题108:地球深部碳循环[C];2017年
2 孙红英;李菁;;气相色谱法测定噻托溴铵中残留甲醇和二氯甲烷[A];山东省药学会第一届学术年会论文集(下)[C];2005年
3 王进欣;;氯甲烷源汇分布、自然生产与生态调节:研究概述[A];《自然地理学与生态建设》论文集[C];2006年
4 田凤鸣;张兴华;陈云琳;;铜基金属有机骨架材料对二氯甲烷和三氯甲烷的高选择性吸附和分离性能的研究[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第六分会:金属有机框架化学[C];2016年
5 李添娣;刘奋;林怡然;贠建培;谢玉璇;何俊涛;;工作场所空气中二氯甲烷溶剂解吸气相色谱测定方法研究[A];第十三次全国劳动卫生与职业病学术会议论文汇编[C];2014年
6 潘红艳;李忠;夏启斌;奚红霞;;二氯甲烷在金属离子改性活性炭上脱附性能的研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(下)[C];2006年
7 顾军;李得月;王长林;;顶空毛细管气相色谱法测定多西他赛中有机溶剂残留量[A];创新药物及新品种研究、开发学术研讨会论文集[C];2006年
8 林碧婵;植建琼;;气相色谱法测定头孢尼西钠中有机溶剂残留量[A];色谱分析在药物分析中的应用专题学术研讨会论文集[C];2004年
9 王国杰;彭顺跃;;氯甲烷加压法合成甲胺磷[A];中国化工学会农药专业委员会第八届年会论文集[C];1996年
10 庞思伟;沈诚辉;伦镜盛;黄通旺;胡忠;;海洋雌激素降解菌的筛选、降解特性研究[A];第五届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文摘要集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴石金;二氯甲烷降解菌的分离鉴定、降解特性及关键酶基因克隆与表达研究[D];浙江工业大学;2009年
2 陆小兰;中国东部陆架海区溴甲烷和氯甲烷的浓度分布和海—气通量研究[D];中国海洋大学;2010年
3 许敬亮;多菌灵降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究[D];南京农业大学;2006年
4 阮志勇;醚磺隆降解菌的分离鉴定、基因组学分析及其降解特性研究[D];华中农业大学;2014年
5 马吉平;氯嘧磺隆降解菌的降解特性和应用研究[D];南京农业大学;2010年
6 骆苑蓉;多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究[D];厦门大学;2008年
7 刘敏;一株二氯喹啉酸内生降解菌及其应用[D];湖南农业大学;2015年
8 齐云;氯苯甲酸降解菌的分离筛选及降解特性研究[D];天津大学;2007年
9 靳竞男;多环芳烃降解菌的筛选及基于靶标酶结构的降解机制研究[D];北京科技大学;2017年
10 吴志国;硝基苯降解菌的分离鉴定、降解途径与关键酶基因的克隆及其细胞固定化研究[D];南京农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李娟娟;分离自苏北盐城盐沼地带的菌株L-1和W2-1-1降解氯甲烷的研究[D];南京大学;2018年
2 程吉;催化还原法处理二氯甲烷废气研究[D];浙江大学;2011年
3 徐涛;吸收—光助氧化法处理二氯甲烷废气研究[D];浙江大学;2012年
4 魏莹莹;真空紫外光解二氯甲烷的去除特性及机理研究[D];浙江工业大学;2011年
5 胡志航;二氯甲烷降解菌的分离鉴定、微生物菌剂及基因文库的构建研究[D];浙江工业大学;2010年
6 傅凌霄;利用潘多拉菌强化生物滤塔去除二氯甲烷废气研究[D];浙江工业大学;2012年
7 张芮;钯催化二氯甲烷羰化合成丙二酸二乙酯的研究[D];华中科技大学;2014年
8 杨飞飞;二氯甲烷肝脏毒性的实验研究[D];济南大学;2016年
9 庄庆丰;二氯甲烷降解菌的选育、降解特性及条件优化[D];浙江工业大学;2011年
10 王斌琦;离子液体法吸收含氯废气的应用研究[D];北京化工大学;2017年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 赵淑玲;二氯甲烷市场拨云见日[N];中国化工报;2013年
2 记者 张梦然;二氯甲烷竟“逃过”联合国监管[N];科技日报;2017年
3 姚宗;进口二氯甲烷反倾销正式立案[N];国际商报;2000年
4 余东晖;我对进口二氯甲烷进行反倾销调查[N];中国商报;2000年
5 记者 张毅;反倾销瞄准二氯甲烷[N];新华每日电讯;2000年
6 张毅;我国对进口二氯甲烷进行反倾销立案调查[N];中国物资报;2000年
7 吕俭;二氯甲烷上涨空间不大[N];中国化工报;2004年
8 记者 刘方斌;二氯甲烷反倾销期终复审立案[N];中国化工报;2006年
9 ;对外贸易经济合作部 国家经济贸易委员会 关于对原产于英国、美国、荷兰、法国、德国和韩国的进口二氯甲烷反倾销调查的终裁决定[N];国际商报;2002年
10 记者 罗阿华;三农公司实现氯甲烷回收[N];中国化工报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978