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家蚕新基因BmEm4的克隆,表达与功能研究

曾凤辉  
【摘要】: 果蝇中的剪切增强子m4基因E(spl)m4是受到microRNA调控的靶基因,它通过参与Notch信号途径来调节果蝇的神经发育,而目前关于家蚕的Notch信号途径及其相关蛋白的研究仍然是一片空白。 我们通过RT-PCR的方法从家蚕中克隆得到果蝇E(spl)m4的同源基因命名为BmEm4[Bombyx mori E(spl)m4],GenBank登录号为FJ436408。该基因ORF框大小为477bp,编码158个氨基酸,预测分子量为18.01KD。通过生物信息学分析发现该基因3’非编码区含有一些高度保守的模体(例如Brd盒子,GY盒子,K盒子和CAAC模体)和两个潜在的microRNA结合位点。我们将扩增到的BmEm4基因克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点上,得到融合蛋白表达质粒pET-28a-BmEm4,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,在24 kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带以包涵体的形式表达,与预期值(融合标签3.56 kDa,BmEm4 18.01 kDa)基本相符,经质谱鉴定正确。我们用Ni柱亲和层析的方法纯化带有His标签的融合蛋白,将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰兔制得多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:25600以上。我们用该抗体来检测该蛋白的组织分布和亚细胞定位。通过免疫印迹、免疫组化和实时荧光定量PCR试验发现BmEm4在家蚕不同发育时期的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显不一致。我们通过Western blotting和免疫组化发现该蛋白在家蚕发育各时期中蛹和幼虫时的表达量较高,而在卵和蛾中很难检测到表达。但是荧光定量PCR结果显示该基因在卵时期的mRNA水平最高,这与该时期很难检测到蛋白表达相矛盾。另外BmEm4蛋白在第三天的五龄幼虫的头部、表皮、肠、气管以及快要吐丝的五龄幼虫的卵巢中都有表达,其中头部表达量最高,而在脂肪体、睾丸、马氏管和丝腺中很难检测到表达,各个组织的mRNA水平和蛋白水平基本一致。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在细胞质中。我们推测BmEm4和果蝇E(spl)m4基因的功能相似,在家蚕的神经发育过程中起着重要作用并有可能受到microRNA的调控。此外,我们还用梯度浓度的Notch信号途径阻断剂DAPT处理家蚕BmN细胞,之后提取细胞的总RNA和总蛋白,用荧光定量PCR和Western blotting的方法检测BmEm4基因的转录和表达水平变化。结果显示,随着处理浓度的增加,BmEm4基因的转录和表达水平均呈现下降的趋势。我们推测家蚕BmEm4基因是Notch信号途径下游的靶基因,其表达受到Notch信号途径的调控。


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