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家蚕凋亡相关基因BmICAD的表达及其功能研究

马月  
【摘要】: ICAD(DFF-45)基因在细胞凋亡过程具有重要的作用。在脊椎动物细胞中,DFF(DNA fragmentation factor)引起DNA的断裂是细胞凋亡中的关键步骤,DFF由蛋白复合体ICAD/DFF-45和CAD/DFF-40组成。ICAD不仅可以抑制CAD的DNase活性,还具有分子伴侣作用。当细胞凋亡信号激活,效应酶Caspase3被激活开始裂解ICAD,释放CAD进入细胞核从而引起DNA裂解和核浓缩。 为了研究ICAD在家蚕细胞凋亡过程中的作用,本研究通过提取家蚕五龄幼虫组织的总RNA,利用RT-PCR的方法获得了BmICAD基因的cDNA序列,该cDNA序列全长844 bp,含有一个522 bp的ORF,编码174个氨基酸残基,预测分子量为19.6 kD,等电点为4.23。将BmICAD基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点中,得到重组质粒pET-28a(+)-BmICAD,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组质粒正确。将该重组质粒转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG低温诱导(25℃)表达后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,与阴性对照相比在25 kD(融合标签为3.84 kD)附近有一条特异性蛋白条带,与预测值相符。重组蛋白主要以上清溶解的形式存在,利用亲和层析的方法纯化重组融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达到1:25600以上。亚细胞定位结果表明BmICAD在家蚕培养细胞Bm5中主要分布在细胞质中。RNAi、MTT检测和DNA片段化检测结果表明BmICAD基因被干扰后会显著增加BmN细胞的凋亡比例。蛋白互作研究结果表明BmICAD与两个蛋白因子——家蚕的DNA超螺旋因子(DNA supercoiling factor,SCF)和家蚕的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)相互作用。以上的研究结果表明,BmICAD具有抑制细胞凋亡的作用,SCF和SPARC两个蛋白因子可能通过与BmICAD的相互作用分别在DNA断裂和细胞凋亡这一过程中起重要作用。


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