家蚕Sir2基因的表达及其功能的初步研究

【摘要】： Sir2 (silence information regulator 2)蛋白家族是一种保守的从古细菌到哺乳动物都广泛存在的NAD+依赖的组蛋白/非组蛋白Ⅲ类去乙酰化酶。Sir2类蛋白(sirtuins)在基因沉默、神经系统、生物长寿等方面都具有重要的调节作用。 从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条基因序列,经NCBI序列比对后推测该基因编码Sir2相关蛋白,将其命名为BmSir2。该基因ORF全长1164bp,编码387个氨基酸残基,GenBank登录号为NM001043472。该蛋白含有1个SIR2超级族中SIRT1结构域,预测该蛋白分子量为43.37 kD,等电点为4.94。我们将BmSir2基因克隆到pET-28a (+)载体中,并转化大肠杆菌Rosetta细胞进行表达。活化的重组表达菌用IPTG进行诱导后,菌体经SDS-PAGE电泳分析,在45 kD左右可观察到一条特异性条带,与预测的目的蛋白大小相符(带His标签大小为47.87 kD)。重组蛋白BmSir2经镍柱纯化后得到高纯度的重组蛋白,并用此免疫雄性新西兰兔,制备多克隆抗体。ELISA检测抗体血清效价达到1：12800,且Western blot检测抗体特异性良好。将家蚕各发育时期和五龄期各组织的总蛋白用自制的多克隆抗体进行检测,了解BmSir2在家蚕各时期和各组织的表达情况。实验结果表明,BmSir2在家蚕卵、蛹、蛾、五龄幼虫期都有表达但表达量不一,在卵期表达量最高,五龄期则最少。因此推测该蛋白在家蚕整个生长周期中都具有重要作用。在五龄幼虫各组织中BmSir2的表达情况差异也很明显,该蛋白只在丝腺中部、脂肪体、气管和头部等组织中有明显表达,在其它组织中则没有明显的表达信号。对家蚕BmN细胞进行目的蛋白亚细胞定位,结果表明BmSir2蛋白主要定位在细胞质中,细胞核中也有少量存在。