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两种硅酸盐细菌特异性PCR方法的建立及应用

吴金光  
【摘要】: 胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌是两种典型的硅酸盐细菌,它们作为生物肥料已长期用于农业生产上,近年在生物冶金和废水处理中也显示了很好的应用前景。目前许多研究致力于筛选胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌菌株以满足各种应用,因此建立这两种硅酸盐细菌的快速鉴定方法对相关研究具有重要意义。 本论文建立了胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌的特异性PCR检测方法,可以成功地用于胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌的快速鉴定,为胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌的应用和开发提供了便捷方法。 首先,以gyrB基因为靶标,设计了4对胶质类芽孢杆菌的特异性引物F1-R5、F1-R8、F2-R5和F2-R8。对4对引物进行了BLASTN搜索、二级结构分析及初步的PCR检测,确定一对引物:F2(5'- ACG GAT ATC TCC CAG ACG TTC AT -3')和R5(5'- ACG GGC ACG CTG CGC CTG TAC G -3')具有较好的特异性,能有效区分胶质类芽孢杆菌和与之亲缘关系最近的土壤类芽孢杆菌,这对引物可特异性地从胶质类芽孢杆菌中扩增出519 bp的单一产物。使用引物对F2和R5,建立了胶质类芽孢杆菌的菌体PCR方法,该方法具有较好的特异性和灵敏度,其检测限在1到10细胞之间。 其次,按照同样的方法,设计了5对土壤类芽孢杆菌的特异性引物F11-R13、F11-R31、F22-R2、F22-R4和F22-R43。经过BLASTN搜索、二级结构分析及初步的PCR检测,确定4对引物(F11-R13、F11-R31、F22-R2和F22-R4)具有较好的特异性,它们能有效区分土壤类芽孢杆菌和胶质类芽孢杆菌。这4对引物可分别从土壤类芽孢杆菌中扩增出一条223 bp、124 bp、235 bp和232 bp的扩增产物。分别建立了4对引物的菌体PCR方法,该方法具有较好的特异性和灵敏度,其检测限在1到10细胞之间。 最后,将以上特异性PCR方法用于检测土壤中的总基因组和硅酸盐细菌分离物。结果,胶质类芽孢杆菌特异性PCR方法能成功扩增一个农业土壤样品的总基因组DNA,获得预期产物;该产物的20个克隆子序列与胶质类芽孢杆菌的gyrB基因序列高度相似。随即,用菌体PCR方法对25个土壤样品分离物进行了检测,其中19个分离物产生阳性扩增,对gyrB基因的测序和序列分析表明这19个分离物属于胶质类芽孢杆菌,其它6个阴性扩增的分离物属于类芽孢杆菌属的其它种。对于土壤类芽孢杆菌特异性PCR检测,只有引物F22-R2和F22-R4从土壤总基因组中产生阳性扩增,但经克隆、测序和序列分析发现扩增产物序列与土壤类芽孢杆菌gyrB基因的同源性仅为78.6-83.2%,引物F11-R13及F11-R31未产生阳性扩增;4对引物也不能从25个分离物中产生阳性扩增,表明这些分离物中没有土壤类芽孢杆菌。可见,胶质类芽孢杆菌特异性PCR可有效用于胶质类芽孢杆菌的应用研究,基于引物F11-R13或F11-R31的土壤类芽孢杆菌特异性PCR也有同样的应用潜力,但有待进一步验证。 综上所述,本论文成功建立了胶质类芽孢杆菌和土壤类芽孢杆菌的特异性PCR方法,为两种菌的应用研究和开发提供了便利。


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