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BmCycH基因及其在家蚕中表达特性的研究

江艳  
【摘要】: 细胞周期依赖性蛋白激酶(Cdk7)是后生动物Cdk激酶(CAK)重要的催化、调节亚基,而Cdk的激活需要自身结合一个调节亚基,也就是细胞周期蛋白H(cyclin H)。在哺乳动物体内,cyclin H与Cdk7、MAT1形成的三元复合物具有CAK激酶的活性,它能磷酸化某些Cdk T环内保守的苏氨酸残基,继而行使Cdk的作用。目前,国内外对cyclin H的研究大多集中在脊椎动物上,而对无脊椎动物的研究较少。 通过RT-PCR的方法从家蚕蛹中扩增到家蚕cyclin H基因完整的ORF序列,GenBank No. AV406047,将其命名为家蚕细胞周期蛋白H(Bombyx mori Cyclin H,BmCycH)。该基因序列长为753 bp,编码250个氨基酸残基,预测分子量为28.34 kD。将扩增到的BmCycH基因克隆到重组表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,构建重组蛋白表达质粒pET-28a(+)-BmCycH,经PCR、酶切鉴定以及序列分析证明重组正确。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导工程菌表达重组蛋白,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在32 kD左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值相符。重组蛋白以包涵体形式存在,将超声裂解菌体后12000 rpm离心所得到的沉淀溶于N-十二烷基肌氨酸钠中,并以亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tag BmCycH。以纯化蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达1:12800以上。 利用荧光定量PCR技术,分析家蚕各个发育时期,以及五龄幼虫不同组织的靶mRNA的量。实验结果表明,BmCycH蛋白在家蚕各个时期都有表达,蛾、蛹、幼虫和卵表达量依次降低;BmCycH蛋白在家蚕五龄幼虫不同组织也均有表达,在头部表达量最高,丝腺表达量最低。提取家蚕各个时期以及五龄幼虫不同组织的蛋白,用于Western blotting实验。实验结果表明各个时期蛋白表达量与荧光定量PCR结果大致相同;而不同组织中蛋白表达量略有不同。这些研究表明BmCycH蛋白在家蚕发育分化过程中可能起到一定作用。利用免疫荧光化学法进行亚细胞定位,结果表明,该蛋白主要存在细胞核中。


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