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鲨鱼肝脏中与肝再生相关的microRNAs研究

张洁  
【摘要】:条纹斑竹鲨,俗称狗鲨,属于软骨鱼类,在我国分布于南海、台湾海峡和东海等海区,是南海最有代表性的软骨鱼类之一。鲨鱼肝脏占据内脏重量的75%,研究表明,其具有较强的肝脏再生能力,体内含有多种生物活性物质,许多研究者已从条纹斑竹鲨中分离克隆了多种与肝再生和免疫调节相关的刺激因子,但尚未有关其肝脏相关miRNA报道。近年研究表明,miRNA在动物肝脏中含量丰富,在肝脏发育、癌变、再生阶段发挥重要作用,因此,开展条纹斑竹鲨肝脏中与肝再生相关的miRNA研究,鉴定与肝再生相关功能基因,将加深动物的肝再生机理认识,并且对推动肝类疾病及海洋生物学的研究工作具有积极意义。 本研究通过条纹斑竹鲨肝脏2/3部分切除模型建立,获得正常、再生6h、再生12h和再生24h肝组织;将正常和再生24h肝组织进行miRNAIllumina测序,所得序列通过与斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Fugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、光滑爪蟾(Xenopus laevis)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、人(Homo sapiens)和小鼠(Musmusculus)的miRNA、miRNA前体序列(pre-miRNA)及米氏叶吻银蛟(Callorhinchus milii)基因组序列进行比对,首次鉴定出条纹斑竹鲨257条miRNA,包括91条已知miRNA和166条非保守的PC(Predicted Candidate)miRNA,其中正常肝组织135条PC miRNA,再生24h肝组织117条PC miRNA,并且31条PC miRNA只在再生24h肝组织检测到,49条PC miRNA只在正常肝组织检测到;这些miRNA隶属于34个基因簇,其中16个基因簇分别由16个共同的前体生成,每个前体生成2条miRNA;统计出已知miRNA在正常和再生24h肝组织中平均reads分别为8173和8972,PC miRNA平均reads分别为1687和1781,但128条PC miRNAreads10,116条miRNA在再生24h肝组织和正常肝组织中的log2reads比值大于1,但其中只有5条miRNA reads10,且只有8条为已知miRNA;对91条已知miRNA采用miRanda v1.0b软件进行靶基因预测,86条miRNA可预测到靶基因,57条miRNA在其靶基因上有多个靶位点,共14163个靶位点;将这些候选靶基因进行GO分析,可映射到38个class,其中“cell proliferation”和“growth”条目各有5条靶基因,相关的miRNA46条。 通过RT-PCR验证7条目标miRNA于正常肝组织都有较高表达,并通过real-timePCR分析其中3条与细胞增殖及凋亡相关的miRNA(xtr-miR-125b、fru-miR-204a、hsa-miR-142-3p_R-1)在正常、再生6h、再生12h和再生24h肝组织4个时间点的差异表达情况,得知3条miRNA在四个不同时间的转录情况存在较大差异,在肝再生6h、12h时表达显著上调,在24h时表达下降趋向于正常水平。为深入全面了解鲨鱼肝再生与miRNA的关系,本研究还完成了6h和12h再生肝组织小RNA库的构建及测序,后期将继续进行miRNA的信息分析及差异验证工作。 本研究还采用20条10碱基随机引物和2条锚定引物对正常和再生24h肝组织通过DDRT-PCR方法进行差异表达基因的筛选,获得10条差异序列;通过Blast检测到其中3条与NCBI EST library的序列有较高相似性,5条序列在再生肝组织中表达上调,另外5条表达下调,这将为肝再生相关功能新基因的生物活性和功能的进一步研究,以及为这些差异表达基因与miRNA的相互作用研究提供有效信息。


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