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毕赤酵母表达XRN1蛋白及响应面法优化基础盐发酵培养基

吴迎春  
【摘要】:5′-3′核糖核酸外切酶(XRN1)是一个在基因表达过程中与RNA代谢和RNA干扰等重要功能相关的保守酶大家族,存在于所有真核生物中,简称5PX。XRN1能持续降解5′端单磷酸的RNA,而不能对5′端三磷酸、5′帽子结构、5′羟基的RNA发挥作用。在总RNA中,rRNA含量最高,原核生物的16S与23S rRNA和真核生物18S与28S rRNA5′端均为单磷酸,末端核酸外切酶XRN1可将这些rRNA降解去除,而达到富集mRNA的目的。 已知酿酒酵母S288c的Xrn1基因序列长4587bp,编码1528aa。通过生物学软件对其蛋白分子量和等电点进行预测,得出分子量约为175kDa,等电点在7.3左右。本论文利用毕赤酵母表达系统重组表达酿酒酵母S288c的XRN1,筛选高效表达XRN1重组蛋白的体系,同时优化基础盐发酵培养基,进行扩大培养及诱导表达,并分离纯化重组蛋白,鉴定重组酶活性,为mRNA的富集奠定基础。 通过构建真核表达载体pPIC3.5K-Xrn1,重组载体经SaI I线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,然后通过甲醇诱导实现了XRN1蛋白在毕赤酵母中的胞内表达。结果表明酵母胞内表达重组菌可以表达全长XRN1重组蛋白,经Westernblotting鉴定其大小约为175kDa,与目的蛋白大小基本相符。用Bradford法可测纯化浓缩后的真核蛋白酶液的浓度;活性检测表明,此重组蛋白具有5′-3′核糖核酸酶活性。 最后利用响应面法对毕赤酵母初始盐发酵培养基进行优化。首先应用Plackett-Burman(PB)设计法对影响XRN1蛋白表达的发酵培养基组分进行筛选,选取的8个相关因子为:酵母提取物、硫酸钙、MgSO4·7H2O、甘油、硫酸钾、磷酸、硫酸铵和氢氧化钾。统计分析表明,影响XRN1蛋白表达的关键因子为酵母提取物、硫酸镁和硫酸钾。再进行最陡爬坡试验逼近3个关键因素的最大响应区域的基础上,采用Box-Behnken Design法对发酵培养基组分进行优化,其最佳条件为酵母提取物0.45%、硫酸镁0.38%和硫酸钾1.4%。在最佳培养条件下,工程菌生物量增加约0.5倍,蛋白表达量提高近40%。


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