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报告基因稳定转化BmN细胞测定BmNPV滴度方法的建立

陈和  
【摘要】:杆状病毒滴度的测定对于杆状病毒的研究具有重要意义。由于传统病毒滴度测定方法存在一定不足,因此,本研究拟建立一种通过报告基因稳转BmN细胞来快速、便捷、准确地测定BmNPV滴度的方法。本方法的基本原理是通过稳定转化的方法将含有多角体基因启动子驱动的报告基因表达盒整合到BmN细胞基因组中,当该细胞感染家蚕杆状病毒后,由于杆状病毒表达的晚期表达因子能活化多角体蛋白基因启动子,从而引发该启动子控制的报告基因的表达,通过检测报告基因的表达来测定病毒滴度,为BmNPV研究中病毒滴度的测定提供一种更快、更准确、更可靠的方法。 本研究所构建的报告基因稳转细胞通过以下三步完成。首先,分别构建了两种含报告基因的转移载体pBacPAK8-DsRed及pBacPAK8-LacZ。然后以pBacPAK8-DsRed及pBacPAK8-LacZ为模板,PCR扩增得到多角体启动子驱动的报告基因表达盒序列,将这两种PCR产物分别插入到敲除OpIE2promoter和OpIE2polyadenylation sequence两个结构元件的pIZT/V5-His载体中,获得重组质粒pIZT-DsRed和pIZT-LacZ。最后,用这两种质粒分别转染BmN细胞,通过Zeocin抗性筛选获得两种报告基因的稳转BmN细胞株:BmN-RFP和BmN-LacZ。 为了验证这两种报告基因稳转细胞的适用性,用BmNPV分别感染BmN-RFP和BmN-LacZ,结果成功检测到了报告基因DsRed和LacZ的表达,而未感染BmNPV的BmN-RFP和BmN-LacZ细胞则未检测到报告基因的表达。此外, Southern Blot分析显示报告基因已整合进BmN细胞基因组中。 进一步,本研究应用这两种稳转细胞株测定不同BmNPV的滴度,结果表明利用这两种细胞株能快速、准确、可靠的测定BmNPV的滴度。


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