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耐酸耐盐多抗细菌的筛选及其对植物几种真菌病害的抑制作用

张帅帅  
【摘要】:真菌性土传病害是农业生产中分布较广、侵染普遍、危害较大的一类植物病害。不合理施肥和植物长期连作种植导致土壤理化性质失衡,产生土壤酸化、盐渍化、病原菌积累和有益微生物减少等系列问题,是诱导土传病害发生的主要原因。本论文针对土壤的酸化、盐渍化现状,以真菌性病害的生物防治为主要目标,筛选具有耐酸、耐盐、拮抗多种病原真菌的功能菌株,探索了功能菌株对几种真菌性病害的防治效果,并进行了菌株其它功能的探索及培养基、发酵条件优化,为生产中真菌性土传病害的生物防治奠定基础。首先,进行耐酸、耐盐、高拮抗活性的功能菌株筛选。从酸性土壤、盐性土壤和喜酸耐盐植物中,采用酸性高盐培养基筛选耐酸耐盐菌株,获得90株耐酸耐盐菌。然后,针对6种植物病原真菌(Athelia rolfsii、Fusarium、I.mors-panacis G3B、Colletotrichum fragariae Brooks、Glomerella cingulata、Botrytis cinerea Pers),通过平板对峙法筛选获得17株拮抗菌,其中10株为Bacillus属,2株为Pseudomonas属,2株Lysinibacillus属,Rhizobium属、Agrobacterium属和Burkholderia属各1株。耐酸耐盐检测结果表明,17株菌均可耐5%Na Cl和p H值为2的酸,其中菌株Pseudomonas LG-1和SH8-4可耐7%Na Cl,菌株Bacillus HZMJW1-10、HZMJW1-11、ZJTZ2、SH8-2、SH8-5、SH8-6和Burkholderia SH8-3可耐11%Na Cl;Lysinibacillus HZLJC2-2和HZLJC2-9可以在p H为2的耐酸培养基中生长。挑选对6种病原真菌抑制率为50%以上的5株菌(Bacillus HZMJW1-10、Bacillus HZMJW1-11、Pseudomonas LG-1、Bacillus ZJTZ2和Burkholderia SH8-3)进行抑菌谱测试,发现这5株菌对其它9种植物病原真菌均具有较强的抑制效果,由此获得5株耐酸耐盐多抗细菌。其次,从5株多抗细菌中选择4株不同种拮抗菌进行抗病和其它功能测试。离体实验采用葡萄果实、番茄幼苗、番茄根部、三七块根和西瓜幼苗为材料,结果表明,4株拮抗菌对葡萄炭疽病、葡萄灰霉病、番茄白绢病、根腐病和西瓜枯萎病的防治效果均达到75%以上;盆栽试验结果表明,在正常土壤(p H为6.8,盐为0.22g/kg)和设施土壤(p H为5,盐为0.45g/kg)中,HZMJW1-10、LG-1和SH8-3对西瓜枯萎病和番茄白绢病的生防效果均达到了100%,ZJTZ2的拮抗活性为66.67%。接下来通过特异PCR对4菌株抗生素合成酶基因进行扩增,结果发现4株菌均具有合成依枯草菌素(Iturin A)的潜能。对菌株产铁载体、IAA及ACC脱氨酶等功能进行检测,发现4株菌株均可产生IAA;菌株LG-1和SH8-3可以产生铁载体,其中菌株SH8-3产量最高,为21.97μg/m L,菌株LG-1具有ACC脱氨酶活性,由此可见这4株菌不仅具有耐酸、耐盐和高拮抗活性的功能,还具有促生的作用。最后,通过单因素试验、正交试验和响应曲面法对4株功能菌的培养基成分、配比和发酵条件进行优化。单因素和正交试验结果表明,菌株HZMJW1-10、LG-1、ZJTZ2和SH8-3的最佳碳源是葡萄糖(2%),最佳无机盐是氯化钾(0.4%),菌株HZMJW1-10和ZJTZ2的最佳氮源是蛋白胨(1%),菌株LG-1和SH8-3的最佳氮源是硝酸钾(1%);4株菌的最适培养条件是28℃、220 r/min、初始p H为7和3%的接种量。通过响应曲面试验探索功能菌最优发酵条件的结果表明,优化后菌株LG-1对葡萄炭疽病病原菌的抑制率为优化前的1.38倍,其它菌株发酵条件在优化后,抑制率都有明显提升。因此,单因素试验、正交试验和响应曲面法可以通过优化功能菌发酵条件来有效提高抑制率,达到最优水平。综上,本研究获得5株耐酸耐盐可拮抗15种常见植物病原真菌同时具有促生功能的多功能细菌,通过优化发酵条件有效提高对病原菌的抑制作用,为由土壤酸化和盐渍化诱导的真菌性土传病害生物防治提供借鉴。


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