三叶青质量差异及生物活性物质基础研究

【摘要】：三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg),是民间珍稀中草药,属于葡萄科崖爬藤属圆脐组植物,广泛分布于浙江、福建、贵州、广西等产地。三叶青的临床应用的潜力巨大,它在抗击新型冠状肺炎疫情中的显示出了卓越出色的药用价值,如今具有广阔的市场。为了提升三叶青药材质量,以及发现其药效基础,本文首先对5个产地样本及对浙产三叶青地下部位进行质量评价,并进一步在生物导向下研究其发挥生物活性作用的物质基础,具体分为对三叶青不同萃取部位进行抗菌能力和抗氧化能力差异的研究,对发挥生物活性的萃取部位其抑菌机制进行初步探讨和有效部位的分析鉴定。最终得到如下主要结论:1.不同产地三叶青块根常规检测及有效成分测定。对5个产地的三叶青块根水分含量、醇溶性浸出物含量测定,结果显示不同产地三叶青样本的水分含量范围为5.97～11.01%;浸出物含量范围为9.24～18.82%;平均浸出物含量为15.04%,均≥9%,符合《浙江省中药饮片炮制规范》(2015版)的要求。不同产地三叶青总黄酮含量和总酚含量最高的分别为浙江温岭和福建沙县;虎杖苷和白藜芦醇的含量最高的为福建沙;紫云英苷含量最高的为贵州天柱的样本;槲皮素和山奈酚含量最高的为浙江温岭。其中浙产三叶青样本具有较高的有效成分生物量。此外本文分析发现三叶青不同指标之间存在相关性。2.浙产三叶青地下不同部位的有效成分含量差异比较。对浙江温岭的三叶青地下部分(大果、小果、须根)和浙江杭州的三叶青须根中有效成分含量进行测定,结果表明三叶青须根中的总黄酮和总酚含量明显高于块根,虎杖苷、白藜芦醇和山奈酚在须根中含量最高,紫云英苷在大果中含量最高。总体而言,三叶青地下部位中须根的有效成分明显高于块根。3.三叶青不同萃取物的抗菌和抗氧化活性研究。依据DPPH、ABTS+结合FRAP的方法比较三叶青不同萃取物的抗氧化活性,结果均显示三叶青正丁醇萃取物具有最强的抗氧化能力。对三叶青不同萃取物进行抗菌活性的研究发现,三叶青石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物对大肠杆菌的抗菌效果最佳;粪肠球菌、铜绿假单胞菌对正丁醇萃取物最敏感;正丁醇萃取物对金黄色葡萄球菌作用最强;石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物均对枯草芽孢杆菌显示出抗菌活性。而三叶青四个萃取物作用于白色念珠菌均不具有或是具有很弱的抗菌活性。由此可见,三叶青正丁醇萃取物为发挥生物活性作用的有效部位。4.三叶青正丁醇萃取物的抗菌机制研究。通过碱性磷酸酶含量测定和扫描电镜观察对大肠杆菌细胞壁的影响,其结果表明三叶青正丁醇萃取物能够通过破坏细胞结构使菌体细胞膜、细胞壁破裂,导致细菌死亡而达到抗菌效果。并且出现菌体之间界线不明显、粘连的现象,造成内容物渗出。因此大肠杆菌对于三叶青正丁醇萃取物的处理较为敏感,且实验表明浓度越高抗菌效果越佳,呈剂量依赖性。5.基于UHPLC-QE-MS技术快速分析三叶青生物活性物质基础。在三叶青正丁醇萃取物中识别出58种化合物,主要存在黄酮类、生物碱类、有机酸类和脂肪酸类成分,还存在少量多酚类、苯并素类和氨基酸衍生物等其他化学成分。黄酮类化合物识别出18种,分别为4种黄酮类,6种黄酮醇类,2种黄烷醇类,2种二氢黄酮醇类(水飞蓟亭和(2R)-6,8-Diglucopyranosyl-4',5,7-trihydroxyflavanone),1 种二氢黄酮类(二氢杨梅素),1种原花青素类(原花青素C1)以及1种异黄酮类(金雀异黄酮)。川陈皮素、金雀异黄酮、水飞蓟亭、Mulberrin、(2R)-6,8-Diglucopyranosyl-4',5,7-trihydroxyflavanone为首次发现的黄酮类化合物。识别出8种生物碱类化合物,包括4种吲哚类生物碱(Psilocin、1-Methoxyindole-3-carbaldehyde、刺桐碱和葫芦巴碱),2种β-卡波林类生物碱(骆驼蓬灵和哈曼尼),1种喹啉类生物碱(5,6,7,8-Tetrahydro-2,4-dimethylquinoline)和 1 种吡咯烷类生物碱(5'-Hydroxycotinine),这8种生物碱类化学成分均为三叶青块根中首次发现。同时还检测出了 6种有机酸类成分,8种脂肪酸类成分,以及17种其他化学成分。该结果提供了三叶青药效物质基础的研究思路。