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网箱鲈鱼内脏白点病病原鉴定及两种快速检测方法的建立

张静  
【摘要】: 鲈鱼(Lateolabrax japonicus)俗称花鲈、七星鲈,隶属于鲈形目,鮨科,花鲈属,是浙江省海水网箱养殖的主要鱼类品种。据不完全统计,2006年浙江省鲈鱼网箱养殖数量超过3万箱,年产量近1.0万吨,产值数亿元。但近年来,随着网箱养殖规模的不断扩大,鲈鱼病害问题亦日渐突出,已成为制约养殖发展的主要瓶颈。2007年5-6月份,浙江省象山港海区网箱养殖鲈鱼暴发一种较为严重的传染性疾病,2008年5月中下旬在象山西沪港海区再次发生该疾病,死亡率达到30%以上,由于发病对象为l kg左右的2龄以上成品鲈鱼,给养殖户造成了很大的经济损失。病鱼症状表现为体色发黑,离群独游或静止在网箱底部,食欲减退,行动迟缓,鱼体消瘦;解剖观察,肠壁增厚发硬,因病鱼肝、脾、肾等内脏组织表面有许多1-2 mm的小白点(结节),被养殖户俗称为内脏白点病。本研究以具有典型症状的濒死病鱼作为材料,通过病原分离、人工感染试验、病原菌形态、生理生化特征与16S rRNA、热激蛋白HSP60鉴定以及PCR(Polymerase Chain Reaction)、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)快速诊断方法的建立,对鲈鱼内脏白点病的病原、诊断技术等进行了较为系统的研究,以期为网箱养殖鲈鱼病害的防治提供参考依据。 本研究分为两个部分。 第一,病原菌分离、确定与鉴定。经分离得到一株优势菌,命名为LY-1。人工感染试验发现,LY-1可致健康鲈鱼发病,并产生与自然条件下发病鲈鱼相似的症状,表明LY-1是鲈鱼内脏白点病的病原。病原菌的主要特征是革兰氏染色阴性,弧形短杆状,可运动,大小约1.4μm×0.8μm,对弧菌抑制剂O/129敏感(150 ug/ml),氧化酶和过氧化氢酶均呈阳性。各项细菌生理生化指标与哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)标准菌株最接近。16Sr DNA、HSP60序列比对和同源性分析均表明LY-1与哈维氏弧菌相似度最高。分子生物学鉴定结合细菌形态观察、生理生化指标等综合判定LY-1为哈维氏弧菌。 第二,哈维氏弧菌快速检测方法的建立。利用弧菌ToxR基因设计引物进行PCR扩增,得到哈维氏弧菌LY-1的一段ToxR基因序列。通过序列比对分析,找出哈维氏弧菌ToxR基因种内一段保守区段,利用该保守区段分别设计PCR与LAMP特异性引物进行核酸扩增,建立了哈维氏弧菌的PCR与LAMP两种快速检测方法。本研究建立的PCR扩增方法可检测出最小检测量为1pg的哈维氏弧菌,利用该方法对LY-1和8株弧菌属标准菌株进行检测,结果发现除LY-1与哈维氏弧菌标准菌株能扩增得到393 bp的特异性片段之外,其他弧菌扩增结果均为阴性,实验中采用二温度点法进行PCR扩增,大大缩短了检测时间,从DNA提取到PCR结束,整个过程只要2个小时;本研究建立的LAMP快速检测技术,具有特异性强,反应时间短,灵敏度高等特点,在65℃孵育45min的条件下即可完成对哈维氏弧菌的特异性扩增,对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1fg,比PCR法灵敏度高三个数量级。 本论文报道了哈维氏弧菌可引起鲈鱼内脏白点病。建立的两种哈维氏弧菌快速检测方法具有操作简单,检出时间短,灵敏度高等优点,为鲈鱼内脏白点病的研究与防治提供了参考。利用LAMP法检测哈维氏弧菌在国内尚属首次报道。


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