巨桉低温胁迫SSH EST文库构建及CBF基因的克隆和表达分析

【摘要】：桉树原产于澳大利亚，生长迅速，木材用途广泛，且能提取具有药用价值的桉油等，已成为世界上最为广泛种植的阔叶树种之一。在我国，桉树已成为热带和南亚热带地区最重要的速生用材树种。在浙江沿海，桉树可作为沿海防护林和景观绿化树种。但大多数桉树属于冷敏感树种，在气候变化异常的今天，低温常常给桉树种植带来不利影响。为研究桉树抗寒的分子机制，促进其抗寒相关的分子辅助育种，培育高抗品种应对低温危害，本研究以巨桉为材料，利用SSH（suppression subtractivehybridization）技术，构建了其低温胁迫下的EST（expressing sequence tag）差减文库，初步分析了低温诱导的相关基因。同时，针对植物在低温胁迫中起重要作用的CBF基因，用同源克隆的方法在低温处理的巨桉材料中进行了分离。并对克隆得到的巨桉CBF基因进行低温等逆境条件下的表达分析，初步研究了它们在巨桉抗低温等逆境中的功能。本文研究结果为桉树的抗寒遗传改良奠定了理论基础。取得的主要研究成果如下： 采用抑制差减杂交技术（SSH），构建巨桉在低温（4℃）黑暗（Tester）和常温（25℃）黑暗（Driver）条件下处理2h的表达基因差减EST文库。通过对文库的测序，获得了280个高质量序列。经功能注释，发现其中包含脂肪酸去饱和酶基因、信号肽酶和Zn2+依赖蛋白基因等与巨桉低温诱导相关的基因。在文库基因筛选过程中，发现编号为88（脂肪酸去饱和酶基因）和93（锌指蛋白基因）的两个序列，在低温诱导下表达量明显上调，表达量分别为对照的22倍和27倍，说明了文库构建的有效、可用。 利用同源克隆方法从低温诱导的巨桉幼苗中克隆到2条CBF的全长cDNA序列，命名为EgrCBF1和EgrCBF2，全长分别为1062bp和1203bp，编码220个氨基酸和196个氨基酸，都包含一个AP2结构域。两个基因编码的蛋白都与冈尼桉中CBF蛋白具有很高的同源性，与EguCBF1a的同源性分别达到了91%和80%。 对EgrCBF1和EgrCBF2基因的RT-PCR分析表明，EgrCBF1主要在叶和根中表达，而EgrCBF2在叶、茎和根中都有表达。对不同温度和4℃不同时间处理下EgrCBF1和EgrCBF2的qRT-PCR分析表明，两个基因都受低温诱导，而且随低温时间的延长，它们的诱导表达特性都呈先升后降的趋势。在100μMABA，200mM NaCl和干旱处理下，EgrCBF1受ABA和干旱诱导；EgrCBF2的受干旱和高盐胁迫诱导。