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巨桉低温胁迫SSH EST文库构建及CBF基因的克隆和表达分析

王京京  
【摘要】:桉树原产于澳大利亚,生长迅速,木材用途广泛,且能提取具有药用价值的桉油等,已成为世界上最为广泛种植的阔叶树种之一。在我国,桉树已成为热带和南亚热带地区最重要的速生用材树种。在浙江沿海,桉树可作为沿海防护林和景观绿化树种。但大多数桉树属于冷敏感树种,在气候变化异常的今天,低温常常给桉树种植带来不利影响。为研究桉树抗寒的分子机制,促进其抗寒相关的分子辅助育种,培育高抗品种应对低温危害,本研究以巨桉为材料,利用SSH(suppression subtractivehybridization)技术,构建了其低温胁迫下的EST(expressing sequence tag)差减文库,初步分析了低温诱导的相关基因。同时,针对植物在低温胁迫中起重要作用的CBF基因,用同源克隆的方法在低温处理的巨桉材料中进行了分离。并对克隆得到的巨桉CBF基因进行低温等逆境条件下的表达分析,初步研究了它们在巨桉抗低温等逆境中的功能。本文研究结果为桉树的抗寒遗传改良奠定了理论基础。取得的主要研究成果如下: 采用抑制差减杂交技术(SSH),构建巨桉在低温(4℃)黑暗(Tester)和常温(25℃)黑暗(Driver)条件下处理2h的表达基因差减EST文库。通过对文库的测序,获得了280个高质量序列。经功能注释,发现其中包含脂肪酸去饱和酶基因、信号肽酶和Zn2+依赖蛋白基因等与巨桉低温诱导相关的基因。在文库基因筛选过程中,发现编号为88(脂肪酸去饱和酶基因)和93(锌指蛋白基因)的两个序列,在低温诱导下表达量明显上调,表达量分别为对照的22倍和27倍,说明了文库构建的有效、可用。 利用同源克隆方法从低温诱导的巨桉幼苗中克隆到2条CBF的全长cDNA序列,命名为EgrCBF1和EgrCBF2,全长分别为1062bp和1203bp,编码220个氨基酸和196个氨基酸,都包含一个AP2结构域。两个基因编码的蛋白都与冈尼桉中CBF蛋白具有很高的同源性,与EguCBF1a的同源性分别达到了91%和80%。 对EgrCBF1和EgrCBF2基因的RT-PCR分析表明,EgrCBF1主要在叶和根中表达,而EgrCBF2在叶、茎和根中都有表达。对不同温度和4℃不同时间处理下EgrCBF1和EgrCBF2的qRT-PCR分析表明,两个基因都受低温诱导,而且随低温时间的延长,它们的诱导表达特性都呈先升后降的趋势。在100μMABA,200mM NaCl和干旱处理下,EgrCBF1受ABA和干旱诱导;EgrCBF2的受干旱和高盐胁迫诱导。


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