冷胁迫下铁皮石斛抗寒基因的克隆与表达研究

【摘要】：铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是传统名贵珍稀中药材，具有益胃生津、滋阴清热等独特功效。因过度采挖、生存环境破坏，野生铁皮石斛资源基本枯竭。21世纪以来，铁皮石斛人工栽培取得了突破性进展，而其抗寒性是制约人工栽培特别是原生态栽培的主要瓶颈。研究铁皮石斛抗寒的分子机制是抗寒品种选育的基础，本文进行了冷胁迫下铁皮石斛抗寒相关基因的克隆与表达研究，取得了如下研究结果： 通过冷胁迫下叶片相对电导率的测定和叶片保护酶的活性大小判定5个家系铁皮石斛的抗寒能力，结果表明：通过叶片保护酶确定的铁皮石斛的抗寒能力与叶片相对电导率计算出的半致死温度确定的抗寒顺序一致，顺序为：EDCBA。 综合常用的RNA提取方法，建立并优化了CTAB+LiCl+RNAiso Plus铁皮石斛RNA提取方法，获得了能够满足后续分子实验要求的铁皮石斛RNA，并为其他多糖类中药材的总RNA提取提供了有益的借鉴和参考。 通过铁皮石斛进行冷胁迫下SCoT差异显示研究，获得11个差异表达片段，分别与膜相关蛋白、渗透调节蛋白、转录因子、抗逆性蛋白有很高的同源性，还有两个基因片段功能未知，可能与铁皮石斛的抗寒有关。 利用其他物种中Actin基因的保守序列设计简并引物，采用RACE技术从铁皮石斛中成功克隆到了Actin的全长cDNA序列。铁皮石斛Actin与其它植物的Actin基因无论是其核苷酸序列还是编码的氨基酸序列都具有高度的保守性和同源性。 利用SCoT差异表达筛选出的HSP70片段，通过RACE技术从铁皮石斛中克隆了HSP70基因全长，该基因全长2296bp，包含一完整的1944bp的开放阅读框，编码647个氨基酸；氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其它植物的HSP70有很高的同源性；冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。