基于叶片解剖和DNA条形码的国兰资源鉴定

【摘要】：国兰是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)植物中的部分地生兰,共有8个物种。由于兰科植物存在自然杂交种,其种质资源的分类与鉴定更为困难。无论是传统的形态学、细胞学、生理生化和分子标记鉴定,都有一定的局限性,未能解决国兰几个争议种的分类问题。本研究通过国兰叶片解剖探究国兰8种植物更多稳定有效的差异特征,从而在解剖水平对国兰植物进行物种间的聚类和比较。通过DNA条形码技术试从分子层面鉴定国兰8个种共计82个野生种和品种,从而进行资源的精准鉴定。主要研究结果如下:(1)对国兰8个种的叶片解剖特征进行试验和比较,同时对叶缘角质层锯齿进行初步观察,选出12个具有分类意义的性状进行赋值,采用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析,聚类结果显示,8种国兰根据叶片结构特征可分为5组:Ⅰ组为春兰和建兰;Ⅱ组为寒兰和墨兰;Ⅲ组为莲瓣兰和春剑;Ⅳ组和Ⅴ组分别为豆瓣兰和蕙兰。(2)取核基因组片段ITS,ITS2和叶绿体基因组片段mat K,rbc L,trn H-psb A进行国兰DNA条形码研究,结果发现国兰ITS和ITS2序列在扩增过程中出现非特异性扩增条带,并在测序中出现双峰现象,不适合作为国兰DNA条形码进行资源鉴定研究,可重新设计特异性强的引物进行扩增测序;而mat K,rbc L和trn H-psb A使用的引物通用性强,扩增成功率均为100%,测序成功率分别为98.8%,98.8%和97.6%。序列特征分析结果显示,变异性最高的是rbc L,保守性最高的是mat K。GC含量最高的是rbc L,为41.5%,最低的是mat K,为31.6%。(3)由种间和种内遗传距离变异度进行综合比对发现,所有单片段及组合片段候选条形码的平均种间遗传距离均大于种内遗传距离,但种间和种内分布均存在一定程度的重叠,其中,mat K和mat K+trn H-psb A的重叠度最小,表明它们在国兰种间和种内遗传变异度相对较大。(4)通过物种鉴定率、单倍型分析以及构建系统发育树的结果来看,单片段DNA条形码的分辨率均不如组合片段DNA条形码高,但组合条形码仍不能完全鉴定国兰全部样品。可能的原因是本研究所收集的国兰野生种和品种因自然界种发生种间杂交,即使所选几个具有代表性的DNA条形码组合也无法将国兰样品全部鉴定,后续可筛选国兰植物高变异位点继续进行国兰资源鉴定研究。