附子甘草活性物质配伍对乌头碱致传代心肌细胞损伤保护作用的实验研究

【摘要】：目的:观察附子甘草活性物质配伍对乌头碱致大鼠传代心肌细胞损伤的保护作用并探讨其机理。方法:采用大鼠传代心肌细胞株作为研究对象,从细胞分子学角度阐述附子甘草活性物质不同配伍对乌头碱致心肌细胞损伤保护作用的相关机制,探讨附子与甘草配伍“减毒增效”的机理,并从中筛选出最佳作用配伍组,为指导含乌头碱药物与甘草的配伍使用提供理论基础。采用MTT法、紫外分光法、Western-blotting等技术检测相关基因的研究方法,从不同层面和角度阐释其作用机理。设立空白对照组、乌头碱组、附甘主要活性物质正交组合9组、异搏定组等12组。通过培养传代心肌细胞株,从形态学观察乌头碱及附甘活性配伍药物作用后心肌细胞形态的改变;利用MTT法检测各组细胞存活率的变化;研究乌头碱及附甘活性物质配伍对心肌细胞能量代谢SDH、Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase 的影响;应用 Western-blotting 技术免疫印迹法分析乌头碱及附子甘草活性物质不同配伍对心肌细胞钙调控蛋白(DHPR-a1、NCX1、RyR2)表达水平。结果:(1)心肌细胞形态学观察:加乌头碱作用4h后,心肌细胞伪足缩短,细胞开始变圆,随着作用时间的增加,细胞的体积变小,少数心肌细胞出现了空泡、颗粒,自发节律搏动减少,节律不规则,出现不规则颤动,心肌细胞皱缩,晚期心肌细胞收缩不明显;附甘配伍各组作用于心肌细胞4h后,在形态、收缩性方面均较乌头碱组有所改善,伪足收缩、包浆空化及颗粒物质均比乌头碱组减少,其中以附甘5组(即60μM乌头碱,60μM次乌头碱,60μM甘草次酸,60μM甘草苷)改善最明显。(2)对心肌细胞活力的影响:120μM浓度乌头碱组细胞存活率明显下降(P0.01),而附甘活性物质不同配伍组合能使细胞存活率均有不同程度改善,具有极显著或显著性差异(P0.01或(P0.05),通过正交组合,细胞存活率中以附甘3组(即30μM乌头碱,120μM次乌头碱,60μM甘草次酸,240μM甘草苷)改善最明显(P0.01),与异搏定组相比,无显著性差异(P0.05)。(3)对心肌细胞能量代谢的影响:120μM浓度乌头碱组SDH活性、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性均显著下降,附甘活性物质不同配伍组合使细胞SDH活性、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性均有显著恢复(P0.05或P0.01),SDH活性以附甘5组(即60μM乌头碱,60μM次乌头碱,60μM甘草次酸,60μM甘草苷)改善最显著(P0.01),Na+-K+ ATPase、Ca2+-Mg2+ ATPase 活性以附甘 4 组(即 60μM 乌头碱,30μM 次乌头碱,30μM甘草次酸,240μM甘草苷)改善最显著(P0.01),与异搏定组相比,部分有极显著性差异(P0.01)。(4)对心肌细胞钙调控蛋白表达的影响:120μM的乌头碱作用于心肌细胞,会导致心肌细胞损伤,使RyR2表达明显上调,而NCX1、DHPR-a1表达显著下降,附甘活性物质不同配伍作用于心肌细胞均能拮抗乌头碱以上作用,在RyR2方面,以附甘3组(即30μM乌头碱,120μM次乌头碱,60μM甘草次酸,240μM甘草苷)降低最显著(P0.01);在NCX1及DHPR-a1方面,以附甘5组(即60μM乌头碱,60μM次乌头碱,60μM甘草次酸,60μM甘草苷)升高最显著(P0.01),与异搏定组相比,无显著性差异(P0.05)。在拮抗乌头碱上调RyR2方面,甘草苷作用较明显,在拮抗乌头碱下调NCX1及DHPR-a1方面,以甘草次酸的调节功能为强。结论:以上结果表明,附甘活性物质不同配伍组合在拮抗乌头碱所致心肌细胞活力下降,改善乌头碱致心肌细胞SDH活性、Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性下降、拮抗RyR2表达上调、NCX1、DHPR-a1表达下调等诸方面均有显著作用。研究发现,甘草苷及甘草次酸均参与了乌头碱的减毒作用,低中浓度附甘配伍组在减轻乌头碱致心肌细胞损伤方面效果较佳(附甘3、4、5组),其作用机理可能是通过调节钙调控蛋白(DHPR-a1、NCX1、RyR2)表达的水平来抑制乌头碱所致的心肌细胞毒性,达到减毒增效的作用,这可能是甘草降低附子毒性的分子作用机制之一,同时为指导附子与甘草的配伍使用提供一定的实验依据。