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基于ARE通路探讨知柏地黄汤抗氧化的作用机制研究

叶丽  
【摘要】:目的:中医认为“火热”是多种疾病的主要病因,应以寒、凉的药物治疗。滋阴泻火法是在临床实践中经常使用的方法,知柏地黄汤是其中一种代表性的处方。此前,对知柏地黄汤的有效治疗作用有许多报道研究然而这一活动的机制仍有待阐明。本研究拟将通过比较知柏地黄汤给药组及正常大鼠各项体征指数变化、能量代谢及氧化应激的变化,从Nrf2/ARE介导的氧化应激信号通路,通过分析代谢组中的差异代谢物以及明确知柏地黄汤在Nrf2/ARE信号通路激活后所调节的靶蛋白,综合分析与探讨知柏地黄汤对氧化应激的调节作用,阐明滋阴降火部分机理,为治疗阴虚“上火”提供理论基础。方法:(1)双荧光素酶报告基因实验筛查对知柏地黄汤敏感的通路,RT-PCR检测ARE通路相关基因(Nrf2、Keap1)的表达,再通过磷钼酸比色法对其进行ATP含量、细胞耗氧率和活性氧ROS的测定,以及黄嘌呤氧化酶法检测SOD的浓度水平。以确定Nrf2/ARE信号通路所调节的下游靶蛋白。(2)SD大鼠进行知柏地黄汤灌胃,测定给药组基础指标及炎症因子的变化,并建立以LC-MS为基础的大鼠血清尿液代谢组学分析方法,结合多元数据分析方法,寻找大鼠的血清尿液差异代谢物,对差异代谢物及氧化关联分析知柏地黄汤对氧化应激通路及机体代谢物改变的作用机制。结果:(1)在双荧光素酶报告基因中我们筛选出ARE这一反应原件,继而确定Nrf2/ARE这一信号通路,通过HepG2细胞检测ATP含量、细胞耗氧率测定,ROS以及黄嘌呤氧化酶法检测SOD的浓度水平,用药组ATP含量、细胞耗氧率以及ROS含量较空白组升高,T-SOD水平下降,CuZn-SOD上升。(2)测定了给药组大鼠与对照组大鼠的体重、脾脏胰腺指数。结果显示体重、脾脏胰腺指数均无显著差异,血常规中有多项指标发生变化。利用LC-MS测定的代谢结果表明知柏地黄汤组与对照组相比有多种代谢物相对差异明显。在血清样品中,脂肪酸生物合成,甘油磷脂代谢和亚油酸代谢途径这三种代谢途径发生明显变化。其中知柏组相对于空白组棕榈酸、亚油酸、油酸含量下降,而溶血磷脂胆碱LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(14:0)、LysoPC(20:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(18:2(9Z,12Z))、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))上升。尿液代谢组中缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径,甘油磷脂代谢和苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成均有显着变化,知柏组中的苯丙酮酸、亮氨酸、缬氨酸、磷酸胆碱含量相对空白组上升。结论:(1)知柏地黄汤的氧化应激保护机制可能是促使ROS活性升高,使HepG2细胞缺氧应激状态提前,从而刺激Nrf2与Keap1解离而活化,从而进一步启动ARE下游的相关保护性基因转录和表达,起到对氧化损伤的保护作用。(2)通过分析大鼠血清与尿液的差异代谢物发现缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸生物合成途径和甘油磷脂途径的相关代谢含量增加可进一步证实知柏地黄汤能够为机体提供氧化能量,提高机体抗氧化能力,为机体的氧化应激起到保护作用。


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