基于激发态分子内质子转移探针的单核苷酸多态性生物传感研究

【摘要】：单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是引起常见疾病的突变类型之一,是人类可遗传变异最常见的一种,SNP的研究已经成为基因组时代的一个热点。本论文基于DNA碱基缺失位点(AP位点)设计的荧光增强型SNP检测方法具有快速,灵敏,背景低的优点。在此基础上,我们运用含有脱碱基位点的DNA作为适配体实现了对天然黄酮类化合物简单,快速的检测。主要研究内容如下： 1.基于有机小分子探针—漆黄素的荧光增强型单核苷酸多态性识别研究 选择可以在脱碱基位点(AP位点)发生激发态分子内质子转移(ESIPT)的3-羟基黄酮类—漆黄素作为探针,建立了简单快速的荧光增强型SNP识别方法。在靶标碱基对应的探针链上引入AP位点有利于漆黄素ESIPT过程的发生,而ESIPT发生的效率则取决于AP位点对面的靶标碱基。通过漆黄素对AP位点的选择性结合来实现SNP识别。实验结果表明：当AP位点对面的靶标碱基为胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)时表现出最强的荧光发射,而当靶标碱基为鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)时的荧光发射要低得多。这种SNP识别方法可以高选择性的区分嘧啶和嘌呤,而且这种对碱基的区分不受AP位点侧翼碱基的影响。此方法的创新点在于实现了无标记的荧光增强型SNP识别。 2.基于核酸脱碱基位点的适配体在天然黄酮类检测方面的研究 采用含有脱碱基位点的DNA作为适配体,这种适配体对漆黄素表现出高度的选择性和灵敏度,而对其他种黄酮类物质(桑色素,芦丁,芹菜素,山奈酚,杨梅素,槲皮素,木犀草素,黄芩素,柚皮素,染料木素,白杨素以及高良姜素)均未表现出此特性。通过这种选择特异性结合可以对漆黄素进行快速的检测。实验结果表明：当信噪比为3时,该检出限可达50nM,我们此方法中所用的适配体不需要任何荧光基团的修饰,因此,荧光背景是完全可以忽略不计的。 3.基于杨梅素对AP位点的靶向识别来实现对AP位点的检测 采用3-羟基黄酮类中的另一种物质—杨梅素作为探针,通过荧光稳态,荧光瞬态,荧光共振能量转移以及DNA熔点的测定等表征方法研究了杨梅素与AP位点的结合特性。实验结果表明：在水溶液环境中,杨梅素几乎不发荧光,而在加入AP-DNA后,荧光发射会有明显的增强,此荧光发射的增强是由于3位羟基和4位羰基之间发生激发态分子内质子转移过程产生了互变异构体。最重要的是,与前面的漆黄素相比,它的荧光增强并不依赖于AP位点的侧翼碱基。因此,杨梅素与AP位点这种荧光增强型结合极有可能发展成为一种实际的低荧光背景传感器,从而对DNA中的AP位点进行识别。这种选择性识别也会被广泛应用于其他方面,例如有效评估DNA的损伤、修复以及抗癌、抗氧化药物的筛选。