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不同根际pH处理下蓝莓根系转录组及氮、铁代谢相关基因表达分析

陈雅彬  
【摘要】:蓝莓(Blueberry)又名越橘,属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)植物,是21世纪新兴保健水果。果实富含花青素、黄酮等生物活性物质,具有抗癌、清除自由基和延缓衰老等功能,而备受推崇。但蓝莓对栽培条件苛刻,限制了其在全国范围内大面积种植。非酸性土壤就是影响蓝莓生长发育的一大重要因素。众所周知,蓝莓适宜在土壤pH4.5-5.5之间生长,超过酸性范围易造成蓝莓生长停滞,叶片黄化等现象。虽然前人对蓝莓不适宜非酸性土壤做了大量研究,但都只停留在营养生理学方面,而从分子生物学角度出发探究其分子机理仍鲜见报道。本论文主要包含4个方面的研究内容。首先以‘夏普蓝’(Sharpblue)等5个浙江省主栽蓝莓品种为材料,设置不同pH根际土壤处理,通过生理生化指标分析筛选非酸性土壤适应性最强的蓝莓品种;其次,利用RNA-Seq技术对蓝莓在不同pH处理下的根系进行转录组测序,获得大量转录本序列;接着,分别构建3个表达谱文库(即pH5.0、pH7.0-3d和pH7.0-6d文库),筛选差异表达基因(DEGs),建立数字基因表达谱;最后,探究了pH和不同氮源形态相互作用对蓝莓生理和氮、铁代谢相关基因表达水平的影响。本研究主要结果如下:1、‘夏普蓝’(Sharpblue)、'奥尼尔’(O'Neal)、'Star'、'布里吉塔’(Brigitta)和‘早蓝’(Earliblue)分别都在pH5.0、pH7.0和pH7.5根际土壤中处理6个月。研究发现在pH7.0和7.5根际土壤胁迫下,5个蓝莓品种的叶片失绿黄化,根系减少发黑,Fv/Fm、叶绿素含量和根系活力均有不同程度地下降,而根系和叶片的铁螯合还原酶(FCR)活性大体上都呈适应性上升趋势。根据上述结果表明北高丛蓝莓(早蓝和布里吉塔)对中碱性土壤的敏感程度大于南高丛蓝莓(夏普蓝、奥尼尔和Star),其中适应性最好和最差的蓝莓品种分别是奥尼尔和早蓝。2、蓝莓根系进行转录组测序后,共获得110,098,570个Clean reads,对其进行de nove转录组组装和拼接后,最终得到287,800条Mixed-Unigene,平均序列长度是526 bp,N50值为997 nt。将获得的Mixed-Unigene序列与几个已知的公共数据库进行比对,结果发现被NR(NCBI非冗余蛋白数据库)、NT (NCBI非冗余核酸数据库)和Swiss-Prot(去冗余蛋白数据库)分别注释上的序列有127,216、77,897和81,531条。在COG(蛋白质直系同源簇数据库)功能分类中,有59,776条序列被分成了25个类别。KEGG(代谢途径数据库)分析表明,有79,995条Mixed-Unigene序列共参与了129条代谢途径。根据NR注释信息,共有86,806条序列被GO(基因功能分类数据库)的生物学过程(Biological process)、细胞组分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)这3个本体进行分类。通过与公共蛋白数据库比对,得到129,972个编码蛋白框(CDS),其氨基酸序列长度大多小于500 nt。简单重复序列(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)分析发现,SSR中双碱基重复个数最多,达到18,938个;SNP中转换变异大约占2/3。3、通过对pH5.0、pH7.0-3d和pH7.0-6d表达谱文库进行两两差异表达基因分析,结果发现pH7.0-3d与酸性对照(pH5.0)相比共得到7,336个差异表达基因(DEGs),其中显著下调的有4,669个,上调的DEGs有2,667个:在pH5.0与pH7.0-6d间,有7,973个DEGs,其中3,650个上调,4,323个下调。KEGG功能分析表明,pH5.0-Vs-pH7.0-3d、pH5.0-Vs-pH7.0-6d和pH7.0-3d-Vs-pH7.0-6d中分别有1,836、2,182和1,054个DEGs被显著富集到6、7和8条代谢途径中。在转录组文库中筛选到超过24种不同家族的转录因子,其中DEGs主要涉及ERF、NAC、WRKY、bHLH和MYB等转录因子家族。等级聚类分析三处理间的表达模式,发现486个DEGs被分成6种模式,其中最多的是上调-上调-下调表达模式。随机选取6条Unigene用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术对RNA-Seq差异表达基因的表达趋势进行验证,结果表明RPKM法和qRT-PCR法测定的DEGs表达趋势相似,两者相关系数R值达到0.8210,呈极显著水平。4、蓝莓分别水培于pH5.0-NH4+、pH5.0-NO3-、pH7.5-NH4+和pH7.5-NO3-介质中处理15 d。结果显示,在pH7.5-NH4+和pH7.5-NO3-处理下蓝莓根系发黑,Fv/Fm下降。叶绿素含量、根系活力和全氮含量在pH5.0-NH4+处理下最高,其次是pH5.0-NO3-,最差的是在pH7.5-NH4+:处理中。与铵态氮源处理相比,以硝态氮为氮源的植株其硝酸含量上升,并与pH相关性不大。与酸性处理相比,碱性处理下显著增加FCR活性,与不同氮源形态相关性较小。5、利用qRT-PCR分析蓝莓根系氮、铁代谢相关基因的表达变化,结果发现与pH5.0-NH4+相比,转录因子(FER)和铁蛋白基因(Fer2)在其它3个处理下表达相对下降,而铁螯合还原酶(FR02)、天然抗性相关巨噬细胞蛋白3(Nramp3)和H+-ATPsae酶(HA)基因表达都上调。铵转运蛋白基因(AMTs)在有铵态氮源下显著上调表达;以硝态氮为唯一氮源时,硝酸转运蛋白(NRT1.5和NRT2)、硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶基因(NiR)被诱导表达均上调,说明这些与氮转运和还原相关的基因主要受不同氮源形态影响。氨同化过程中的谷氨酰胺合成酶(GSs)和谷氨酸合成酶基因(GOGATs)在高pH胁迫下表达下降,并与氮源形态相关性不显著,表明氨同化相关基因主要受pH影响。


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