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以斑马鱼胚胎为例探究低浓度砷的心脏毒性效应及机制

张晶莹  
【摘要】:砷(Arsenic,As)是一种类金属元素,有剧毒,普遍分布在自然界中。近年来随着社会经济的发展,工农业生产生活向空气、土壤和水体中排放了大量含砷物质,这些来源通过各种途径汇集到水环境中,使得水体中的砷污染愈发严重,已经引起了人们的广泛关注。水体中砷主要以无机砷的形式存在,且价态主要为三价砷(AsIII)和五价砷(AsV)。目前已有大量的研究报道了高浓度砷对鱼类的危害,而关于低浓度砷对鱼类的危害鲜有报道,但现在越来越多的证据表明低浓度砷对水生生物具有一定的潜在环境风险。因此,本研究以斑马鱼早期发育阶段为研究对象探究地浓度砷对鱼类的毒性影响,以期进一步探讨和完善低浓度无机砷对水生生物生长发育的毒理学效应。实验数据显示:(1)通过急性毒性暴露实验,我们发现:暴露斑马鱼胚胎120 hpf,≥25μg L~(-1)的AsIII明显抑制了斑马鱼的存活率(p0.05),而斑马鱼胚胎的畸形率在≥50μg L~(-1)开始出现显著性增加(p0.05),畸形的主要的形态学变化为心包囊肿、脊柱弯曲和尾部弯曲。此外,通过观察胚胎的胎动我们发现,随着AsIII暴露浓度升高,暴露组胎动显著降低(p0.05)。不同于AsIII,仅有50μg L~(-1)的As V对斑马鱼的存活率表现出明显的抑制效应(p0.05),而处理组中胎动显著性降低,与AsIII相比基本指标的毒性相对较弱。结果表明,水环境中低浓度无机砷对斑马鱼早期发育阶段具有一定的发育毒性,且价态不同,带来的毒性也会有一定的差异。(2)通过氧化应激相关实验,我们发现:随着AsIII浓度的升高,SOD(Superoxide dismutase)活性显著性升高(p0.05),脂质过氧化产物MDA(Malondialdehyde)的含量随之显著增加(p0.05);除此之外,25μg L~(-1) AsIII诱导抗氧化系统相关基因Cu/Zn-SOD的mRNA表达,随后随着AsIII浓度浓度的增加表达量显著性降低(p0.05),同时≥75μg L~(-1) AsIII的暴露导致HSP70的mRNA表达显著性增加(p0.05)。对于AsV暴露组来说,与毒性较高的AsIII暴露效果不同的是,SOD活性的显著性增加现象在≥50μg L~(-1)时开始出现,且MDA含量的显著性增加出现不稳定的趋势表现,但是依然可以看出AsV对斑马鱼胚胎造成的氧化应激压力;在抗氧化系统相关基因表达量上,实验数据显示AsV浓度在≥25μg L~(-1)就对Cu/Zn-SOD以及Mn-SOD产生显著性的诱导效应,对HSP70的mRNA表达造成先诱导后抑制的影响,对MT-1和MT-2的mRNA表达均呈现抑制影响。结果表明,水环境中低浓度无机砷可诱导斑马鱼早期发育阶段产生过量ROS并造成氧化损伤,破坏抗氧化系统。(3)通过对心脏相关发育指标检测发现,AsIII和AsV的暴露,均能产生心脏发育畸形,造成心率紊乱现象的出现,并诱导斑马鱼幼鱼心脏产生凋亡。随着暴露浓度的升高,两种价态处理组心脏凋亡细胞逐渐增多。除上述指标以外,心脏发育相关基因的表达均受到不同程度的抑制或激活影响。≥25μg L~(-1)的AsIII对GATA4 mRNA的表达水平产生抑制,相反激活GATA1、Mdm2以及MMP-2的mRNA表达;而As V暴露组在≥25μg L~(-1)时对GATA1和Mdm2的mRNA表达水平均产生先激活后抑制的影响,而抑制GATA4和MMP-2的mRNA表达。表明水环境中无机砷暴露,即使是低浓度的AsV,也会致使斑马鱼胚胎心脏发育异常,诱导其产生心脏毒性效应。(4)通过凋亡相关实验,我们发现:随着AsIII和AsV浓度的增大,Caspase-3酶活性均出现了显著性升高的现象。线粒体依赖的凋亡信号途径中,关键基因Bax、Bcl-2、Bid和Caspase-9、Caspase-3的mRNA表达水平显示出不同程度的上调,且两种价态无机砷暴露均破坏了Bcl-2/Bax的平衡;此外,AsIII诱导Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达量增加,AsV对Casepase-3以及Bax蛋白表达量均产生抑制影响,而激活Bcl-2蛋白的表达。结果表明,斑马鱼胚胎在低浓度无机砷的暴露下,心脏凋亡的发生可能是由于低浓度无机砷的暴露激活了心脏的线粒体依赖的凋亡起始通路。研究通过利用不同层次(包括个体、细胞、分子水平)的生物实验技术探讨了无机砷对斑马鱼早期发育尤其是心脏发育的毒性效应和相关机制,为进一步研究水体环境中低浓度无机砷的环境毒理学机理提供实验室数据支持。


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