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利用宏基因组方法获得新酯酶基因及酶学性质研究

周秀玲  
【摘要】:酶是一种十分重要的多功能催化剂,现已被广泛应用于食品与生物工程等领域。如现已应用于食品工业、生物医药、手性药物拆分及其新型的生物材料等领域。酯酶已成为工业生产中酶催化剂应用最广泛的一类酶,也是目前在工业生产中被重点研究的酶催化剂。 土壤中大部分微生物是不可培养的,这限制了微生物资源的开发和利用。本研究利用宏基因组DNA技术直接分离未培养环境微生物基因组DNA,构建土壤宏基因组文库,通过功能筛选的方式从宏基因组中分离获得一个新的酯酶基因"EstC28-1".宏基因组技术,使得占微生物总量99%的不可培养微生物资源开发成为了现实。随后,对该酶进行了序列分析、克隆、表达和纯化。并对纯化后的酶进行了常规的酶学性质的表征,如最适反应温度的测定、热稳定性的测定、底物特异性分析。 实验结果表明,从宏基因组文库中分离得到的酯酶EstC28-1,利用DNA重组技术将酯酶EstC28-1基因克隆到表达载体pPIC9K中,重组载体电击转化到毕赤酵母基因组上,通过酵母菌落PCR及三丁酸甘油酯培养板的筛选,获得阳性毕赤酵母基因。温度为30℃的条件下,转速为250r/min培养5天后,离心收集发酵液上清,发酵液上清用PEG-20000进行浓缩后,浓缩液用60%饱和度的硫酸铵进行盐析纯化和凝胶层析后,所获得的纯度大于90%的蛋白。EstC28-1酶学性质表明:最适温度为45℃,温度在25℃-35℃时,酯酶的活性保留85%以上,EstC28-1是一种中温酯酶。对pNPC8表现出最大的水解活力,最适合pH值为9.0。酯酶EstC28-1在高logP的浓度为20%和50%的苯和烷烃稳定性比较好,72h后,活性仍是原有活性的2-3倍,耐有机性好。Mg2+和Ba2+金属离子随着浓度的增加对酯酶EstC28-1活性的增强作用也越来越明显,说明这两种金属离子对酯酶EstC28-1有激活作用。这些结果表明,酯酶EstC28-1在工业生产过程中具有潜在的使用价值。


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