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贻贝蛋白中ACE抑制肽的制备及其构效关系研究

张艳萍  
【摘要】:贻贝(Mytilus sp.),属软体动物门(Mollusca)瓣鳃纲(Lanellibranchia)异柱目(Anisomyaria)贻贝族(Mytilacea)贻贝科(Mytidea),是一种蛋白质含量较高的贝类水产。我国是目前世界上贻贝产量最大的国家,年产量超过60万吨。而由于加工技术落后,我国有90%的贻贝用于生鲜、冷冻制品的出口,导致贻贝的附加值低下,蛋白质资源浪费严重。本论文以紫贻贝为原料,对其蛋白质组成、营养价值、酶解特性进行系统分析,并对贻贝分离蛋白的提取及酶解制备ACE抑制肽进行了研究,旨在为贻贝的深度开发和利用提供理论依据和有效途径,实现贻贝资源的高效增值。 论文首先就贻贝粉的化学组成、脂肪酸及矿物质元素含量进行分析。结果表明其化学组成为:水分5.02%,灰分13.09%,脂肪7.04%,蛋白质48.44%,碳水化合物23.75%;脂肪酸分析结果表明:贻贝中含有丰富的PUFA(31.09%),其中含量最高的为EPA和DHA,其含量分别为12.21%和7.18%,饱和脂肪酸中含量最高的为棕榈酸(29.95%),单不饱和脂肪酸中棕榈油酸最为丰富(10.07%);而且,紫贻贝中含有丰富的Ca、Mg、A1、Fe、Zn和Se等元素。 采用95%乙醇作为脱脂溶剂,将贻贝粉脱脂得到贻贝蛋白,其蛋白质含量高达60.23%。通过Osborne法分析其蛋白组成发现:贻贝蛋白中碱溶性蛋白含量最高(40.78%),其次是水溶性蛋白(24.59%)和醇溶性蛋白(6.88%),盐溶性蛋白含量最低(1.62%)。氨基酸分析表明,贻贝蛋白及其各个蛋白级分的氨基酸构成比较平衡,均含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和丝氨酸,且必需氨基酸比例较高。营养特性分析表明,碱溶性蛋白的氨基酸评分(111.25)最高、蛋白质功效比最高,醇溶蛋白的生物价最高,碱溶性蛋白(65.44)次之。综合评价,贻贝蛋白中碱溶性蛋白的营养价值最高。 考察不同蛋白酶对贻贝蛋白的酶解效果,结果表明:碱性蛋白酶Alcalase是生产贻贝蛋白ACE抑制肽的最适用酶,其水解贻贝蛋白4h后水解度(DH)为20.68%。较其它五种蛋白酶的作用,其酶解物的蛋白质回收率(PR)最高(85.77%),ACE抑制活性最强(IC50为66.34μg/mL)。且酶解产物主要分布在相对分子量为200-1000 Da的区间(54.36%)。 比较不同蛋白级分对酶解物ACE抑制活性的贡献程度,确定碱溶性蛋白是赋予贻贝蛋白酶解物ACE抑制活性的优势蛋白级分。根据贻贝蛋白组成特点及其对ACE抑制活性的贡献度,确定采用碱溶酸沉工艺制备贻贝分离蛋白(MEPI)并优化了工艺条件,在优化的工艺条件下(料液比1:30,pH11.5,温度35。C,提取2.5小时,酸沉pH值为3.5),蛋白提取率为81.74%,蛋白质含量为74.32%。 以DH和IC50-1为评价指标,通过单因素试验和响应面分析(RSM)确定Alcalase酶解MEPI制备ACE抑制肽的最佳酶解条件为:[E]/[S]=1.73%、pH9.2,温度56.8℃。在此条件下酶解所得产物的DH为25.4%,ACE抑制的IC50为35.21μg/mL。稳定性实验结果表明:MEPI酶解物在常规的食品加工条件下(20-100℃、pH2-10)具有良好的稳定性,且能在很大程度上抵抗消化酶的水解作用。并且,结果表明其是ACE的竞争性抑制剂。 探讨了DH对酶解物的化学组成、相对分子量分布、氨基酸组成及ACE抑制活性的影响,结果表明:随着DH的增大,蛋白质含量缓慢增加;相对分子量范围在200-1000 Da的组分含量显著增加而后维持恒定;疏水性氨基酸、芳香族氨基酸及支链氨基酸的含量显著增加,酸性氨基酸的含量显著下降。这在一定程度上解释了DH对酶解物活性的影响趋势:随着DH的增加,酶解物的ACE抑制活性逐渐增强,但当酶解进行到一定程度,酶解物活性呈稳定或略微下降趋势。对水解过程进行动力学拟合表征,结果表明:MEPI的DH和水解产物的ACE抑制率的动力学回归方程为:DH=-4.24195+5.43497 1n(T-2.73073),R2=0.9934;而ACE抑制率随时间变化的回归方程为I(%)=47.68838+0.91943T-0.00559T2+1.30899×10-5 T3-1.06897×10-8T4,R2=0.8384。研究了料液浓度、操作压力、操作温度对膜通量的影响以及超滤膜对酶解物活性的影响,根据结果选择10 KD的超滤膜对MEPI酶解物进行超滤分离(料液浓度15 g/L、操作压力20 psi、操作温度25℃);而后采用Sephadex G-10凝胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱和半制备RP-HPLC等分离手段从MEPI酶解物中分离出VW、LGW和MVWT三种活性较强的ACE抑制肽,对应的IC50值分别为1.7μM、30.0μM、143.3μM;且均属于抑制剂类型。 以VSHE描述子进行结构表征,比较了PLS、SVM和PCA-SVM对不同氨基酸残基数目的ACE抑制肽的建模结果。结果显示:对于ACE抑制二肽,三个模型结果相当;对于ACE抑制三肽,SVM模型和PCA-SVM模型的拟合能力明显优于PLS模型,而预测能力相当;对于ACE抑制四肽、五肽和六肽,SVM模型和PCA-SVM模型的拟合能力及预测能力尤其显著。同时发现,ACE二肽中,C末端氨基酸较N端氨基酸对其活性的影响更为明显;ACE抑制三肽的中间位置的氨基酸对其ACE抑制活性的影响最为显著;对于ACE抑制四肽,N端的三个氨基酸残基对其活性的影响较为明显;而对于ACE抑制五肽和六肽,C端的四个或五个氨基酸残基对其活性的影响较为显著。 并且,采用贻贝中的ACE抑制肽对模型进行检验,结果表明:本论文所建ACE抑制肽的QSAR模型能够对已知结构的ACE抑制肽的活性进行准确预测,其中,SVM模型与PCA-SVM模型的预测结果最为准确。


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