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手性农药糠菌唑的立体选择性行为及毒理研究

吴淑春  
【摘要】:三唑类杀菌剂既有杀菌作用又有植物生长调节作用,因而在农业上被广泛应用,但这同时也对食品安全和人类健康构成了一定的威胁。该类化合物因含1个及以上手性中心而存在手性对映异构体,属手性农药。手性对映异构体在非手性环境中虽具有相同的理化性质,但与生物体内的手性药物靶标作用后,往往会表现出立体选择性吸收、分布、降解和毒性效应等行为。本课题以糠菌唑为主要研究对象,以肝微粒体、大鼠为体外、体内动物模型,主要研究了手性农药糠菌唑的生物立体选择性行为、肝毒性效应和毒理机制。为手性农药糠菌唑的风险评估、农产品食品安全、生态环境和人体健康保障提供了更加准确、全面的研究基础和科学依据。主要内容包括以下三方面:(1)采用体外孵育的方式对糠菌唑在大鼠、兔、狗、小鼠和人肝微粒体中及多效唑在大鼠肝微粒体中的立体选择性降解和酶促反应动力学进行分析。(2)采用单次灌胃给药的方式对糠菌唑在雄性大鼠体内的立体选择性吸收、分布、降解和主要代谢物及四种代谢酶基因转录响应进行分析。(3)采用生理学、病理学、代谢组学、转录组学、分子对接、RT-q PCR、Western blot等研究手段,系统分析糠菌唑致雄性大鼠肝毒性效应和毒理机制。以肝微粒体为模型,采用体外孵育的方式和HPLC-MS/MS、VCD技术,建立了糠菌唑对映体和多效唑对映体在肝微粒体中的提取、净化、拆分和定量分析方法,并确定了糠菌唑4个对映体的绝对构型。研究了糠菌唑、多效唑对映体在肝微粒体中的立体选择性降解行为。结果表明外消旋体糠菌唑在大鼠、兔、狗、小鼠和人肝微粒体中孵育后,4个异构体均遵循一级降解动力学,但在人和小鼠肝微粒体中的代谢速率相对较慢。(2S,4R)-和(2R,4S)-糠菌唑在5种供试肝微粒体中的立体选择性趋势一致;(2R,4R)-和(2S,4S)-糠菌唑只在兔肝微粒体中有显著性立体选择性降解(P0.001),而在小鼠肝微粒体中几乎没有立体选择性降解。酶促反应动力学结果也证实了糠菌唑降解存在立体选择性及种属差异。多效唑在大鼠肝微粒体中的降解动力学和酶促动力学分析显示,(2S,3S)-多效唑在大鼠肝微粒体中被优先降解和清除,表现出明显的立体选择性降解行为。以大鼠为实验动物,分别单剂量灌胃13.8 mg/kg剂量的4种光学纯糠菌唑和外消旋糠菌唑,采用HPLC-MS/MS法和定量PCR技术,分析了糠菌唑对映体在大鼠体内的吸收、分布、降解、主要代谢物及四种代谢酶基因表达情况。结果表明糠菌唑在大鼠组织(肠、肝脏、肺、心、肾和睾丸)中的降解均符合一级动力学,降解半衰期为0.56~6.48h,糠菌唑对映体在大鼠组织内的吸收、运输及降解存在立体选择性,但不同组织中的立体选择性不同,对于(2RS,4RS)-糠菌唑,肠、肺、心、肾、睾丸中均为(2R,4R)-糠菌唑浓度较高,而肝脏中(2S,4S)-糠菌唑浓度较高;对于(2RS,4SR)-糠菌唑,肠、肝脏、睾丸中为(2R,4S)-糠菌唑浓度较高,而肺和肾中(2S,4R)-糠菌唑浓度较高;同时(2RS,4RS)-糠菌唑浓度低于(2RS,4SR)-糠菌唑。代谢物检测结果表明糠菌唑在大鼠体内主要发生了羟基化、二羟基化和羟基取代溴反应,其中肠中糠菌唑代谢物相对浓度最高,肺中代谢物种类相对丰富;(2S,4S)-糠菌唑代谢物种类少,相对含量低,可能与其在肠、肺、心、肾、睾丸中均被优先降解有关;(2R,4S)-糠菌唑代谢物种类多,相对含量高,可能与其在组织中含量高,降解速度最慢有关。糠菌唑对大鼠肝脏中Cyp1a2、Cyp2d4、Cyp2e1和Cyp3a1 m RNA表达量的影响结果表明糠菌唑对cyp2e1和cyp3a1表达的上调作用最明显,其次是cyp1a2,再次是cyp2d4。通过比较分析4个光学纯糠菌唑对cyp3a1、cyp2e1、cyp1a2和cyp2d4基因表达的影响水平,我们发现(2R,4S)-糠菌唑对肝四种代谢酶基因表达影响较低,(2R,4R)-糠菌唑对肝四种代谢酶基因表达影响较高。rac-糠菌唑对cyp3a1、cyp2e1表达的影响普遍低于光学纯糠菌唑,对cyp1a2、cyp2d4表达的影响普遍高于光学纯糠菌唑,表明不同对映体对大鼠肝脏中四种代谢酶基因表达水平的影响存在差异。以大鼠为实验动物,采用分别连续灌胃0,13.8,32.8和65.6 mg/kg/d剂量的糠菌唑10天,结合代谢组学和转录组学分析,研究了糠菌唑对大鼠生理、病理、毒性效应的影响和毒理机制。生理和病理实验结果表明,短时间糠菌唑暴露会引起肝脏组织损伤和肝脏生化指标改变,如天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、丙酮酸(Pyr)和总胆固醇(TC)等。转录组学和代谢组学分析结果表明,高剂量糠菌唑暴露后有58个代谢物和259个基因发生显著变化,并且脂肪代谢和胆汁酸代谢途径均发生显著性变化。分子对接分析结果表明,糠菌唑可以与PPAR-γ相互作用;Western blot和RT-q PCR分析结果表明,糠菌唑显著降低PPAR-γ在肝脏中的蛋白和基因表达,推断糠菌唑可通过抑制PPAR-γ信号途径降低脂肪的合成。以上结论表明短时间糠菌唑暴露可能会在生理、代谢组和转录组水平上导致大鼠肝毒性,并为糠菌唑诱导哺乳动物肝毒性的毒理机制推测分析提供重要的依据。


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