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黑芥子酶提取分离、性质及固定化研究

刘月萍  
【摘要】: 黑芥子酶(EC3.2.3.1)存在于十字花科植物中。在一定的条件下,黑芥子酶可以将硫代葡萄糖苷分解,生成葡萄糖、硫酸盐、异硫代氰酸盐、乙腈、硫氰酸盐等物质。酶解产物,特别是异硫代氰酸盐具有生物活性,其中萝卜硫素的抗癌效果最好。萝卜硫素是4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷的酶解产物,而4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷在西兰花中的含量是最高的。但是,日常的食物加工制备(如加热烹饪)会影响4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷转化为萝卜硫素,要保证有足够水平的抗癌物质的摄入,需要使用纯制剂来研究它们的实际作用。因此,需要利用黑芥子酶的作用,产生更多有利于人类的物质,才能达到更好防癌及抗癌的作用。本文主要研究了西兰花中黑芥子酶的提取分离、性质及固定化。 为了从西兰花中提取出更多量、更纯的黑芥子酶,本文研究了西兰花中黑芥子酶的提取、纯化方法。用pH7.5、0.2MOL/L Tris-HCl缓冲液为抽提缓冲液,抽提效果最好;用液氮研磨破碎细胞,可以使细胞彻底破碎;用2倍体积的乙醇沉淀黑芥子酶,比用硫酸铵沉淀的效果好,可以使黑芥子酶的比活力达到最高。在提取缓冲液中加入二硫苏糖醇、甘油、苄磺酰氟和乙二胺四乙酸等物质,可以提高黑芥子酶的活力。粗酶经2倍体积的乙醇沉淀后,再经DEAE-Sepharose离子交换柱层析以及Superdex~(TM)—200凝胶过滤柱层析基本达到纯化效果,得到纯的黑芥子酶。黑芥子酶的纯化倍数分别为酶粗提取液的1.75倍,31.1倍和45.65倍;产率分别为粗酶提取液的64%,29%和9%。西兰花各部位中,种子中的黑芥子酶的比活力最高。 在酶解的过程中,黑芥子酶需在特定的条件下才能表现出最高活力,研究了黑芥子酶的性质。西兰花中黑芥子酶的分子量约为50KDa。最适pH为6.0,在pH为5-7之间保持稳定,短时间内最佳反应温度为45℃,55℃以上酶的稳定性急剧下降。以烯丙基硫代葡萄糖苷为底物,K_m值为1.95mmol/L。加入1mmol/L维生素C,黑芥子酶的活力约为原来的2倍。 游离酶在酶催化反应中很难反复或连续使用,也很难实现连续化,自动化,为了解决这一难题,研究了黑芥子酶的固定化。以海藻酸钙为载体,戊二醛为交联剂,成功将黑芥子酶进行固定化。研究了海藻酸钠的浓度和戊二醛的浓度对黑芥子酶固定化的影响,并对固定化黑芥子酶酶促反应的最适pH、pH稳定性,最适反应温度、热稳定性,K_m值等进行了测定。结果表明,4%的海藻酸钠、0.2%的戊二醛条件下对黑芥子酶的固定化率最高。酶促反应特性测定结果表明,固定化后黑芥子酶的最适pH范围增大,既耐酸又耐碱,pH的稳定性也增强。最适反应温度没有很大的改变。热稳定性的范围变宽了,当温度达到65℃以上,固定化黑芥子酶的活力开始急剧下降,而游离酶的活力从55℃以上就开始急剧下降了。固定化黑芥子酶的K_m值为5.10mmol/L,与底物的亲和力比游离酶相比有所下降,总活力为游离酶的70%。


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