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山核桃青衣多糖的提取分离、结构和活性研究

张婷  
【摘要】: 浙江山核桃(Carya cathayensis Sarg.)乃浙江省重要经济植物,营养美味深受消费者喜爱;而山核桃果实外青衣通常被当作废物丢弃,既污染环境,又浪费了有用的资源,应对其进行研究开发,并加以利用。现有的糖生物学研究成果表明,植物多糖具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等多种功效,且毒副作用较小,受到广大专家学者的关注。因此,开发利用山核桃青衣多糖具有理论和实际意义。 本文以山核桃青衣为原料进行了山核桃青衣多糖的提取、分离研究,并分析了从山核桃青衣多糖粗品中纯化所得的单一糖组分的结构利活性。 通过正交试验对山核桃青衣多糖的提取条件进行了优化,最佳提取条件为:料液比1:15,浸提温度70℃,浸提时间150min。经苯酚-硫酸法测定最佳提取条件下的多糖得率为0.927%,该条件下所得多糖粗品命名为PSW。 在分离纯化研究中,比较了三氯乙酸法和Sevag法等脱蛋白工艺的优劣,综合考虑试剂消耗、多糖结构和活性的保存等因素,选择Sevag试剂反复脱蛋白7次的工艺流程。并进一步研究了脱色、透析、Sepharose 4B凝胶柱层析和DEAE sepharose FF离子交换柱层析等纯化手段在分离纯化PSW中的应用,最终确定将PSW溶液用10%的活性炭在60℃下脱色2h,过滤去除活性炭,并用14 000分子量的透析袋对水透析,最后用DEAE sepharose FF离子交换柱(2.0×20cm)和Sepharose 4B凝胶柱(2.0×40cm)进一步纯化,精制得到的糖组分命名为PSW-1。经高效凝胶色谱和醋酸纤维电泳分析确定PSW-1为单一组分,纯度达95%以上。 采用红外光谱分析PSW-1的官能团特征,结果表明PSW-1有羧基的特征吸收峰,说明其为含糖醛酸的酸性多糖;硫酸咔唑法测得其糖醛酸含量为61.9%,硫酸咔唑法和地衣酚法分析其C/O比值接近1,据此判断PSW-1是含有葡萄糖醛酸的杂多糖。气相色谱分析结果显示PSW-1是含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖四种中性单糖的杂多糖,各中性单糖的摩尔百分比为:12.6%:20.1%:23.0%:44.4%。高效凝胶色谱(HP GPC)法测得PSW-1的分子量为133 021D。已有的多糖研究经验表明,酸性杂多糖一般都具有较强的生物活性,且活性最强的多糖的相对分子量都集中于100 000~200 000 D之间。因此,根据以上实验结果可以推测PSW-1是一种高活性的多糖化合物。 抗氧化实验表明,PSW-1具有一定的抗氧化能力,当样品浓度达到1mg·mL~(-1)时,对DPPH·清除率达54.4%,作为一种植物来源的抗氧化物质,它可能具有性质温和,毒副作用较小的特点,有一定的利用价值。 体外免疫实验中,PSW在100.00μg·mL~(-1)的浓度下显示出免疫增强作用;而PSW-1在10.00μg·mL~(-1)和100.00μg·mL~(-1)浓度下均具有免疫增强作用,说明经纯化了的PSW-1的免疫调节作用优于PSW;而在ConA和LPS的诱导作用下,0.01,0.10,1.00,10.00和100.00μg·mL~(-1)的PSW和PSW-1均能极显著地促进脾细胞增殖,其中,由ConA诱导的脾细胞经PSW-1刺激后的增殖作用更明显,说明PSW-1能更有效地刺激T淋巴细胞增殖。 体内免疫实验表明80mg·kg~(-1)·day~(-1)的PSW-1能够极显著地增强小鼠的迟发型超敏反应。说明PSW-1能在体内有效刺激T细胞增殖,增强免疫力。


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