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一株脂肪酶产生菌的筛选鉴定、发酵条件优化及其酶学性质研究

周晶  
【摘要】:脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)全称甘油三酰酯水解酶(Triacylglycerolacylhydrolase),是最早研究的酶类之一。由于其本身界面酶学性质的特殊性,已在食品与营养品生产工业、日用品工业、化工和洗涤剂工业、药物合成以及生物表面活性剂合成等许多领域得到了广泛的应用。另外利用脂肪酶催化餐饮废弃油脂制备生物柴油,不仅可以解决日益严重的废弃餐饮油脂问题,更可以生产绿色能源——生物柴油,成为近年来脂肪酶应用研究热点之一。因此,无论从环境方面还是从综合经济方面考虑,筛选和研究微生物脂肪酶都具有重要的意义。 为了获得对餐饮废弃油脂具有底物特异性的微生物脂肪酶,本文从被餐饮油脂污染的土样中,经过两轮平板筛选,得到7株可以在以橄榄油为单一碳源的油脂同化平板生长,并产生黄色变色圈的菌株。通过摇瓶培养和酶活测定,选取31号真菌进行菌种鉴定工作。结合菌株形态特征与ITS序列分析结果,初步确定CJLU-31为米曲霉属,并将其命名为Aspergillus oryzae CJLU-31。 通过单因素试验和正交组合试验,优化了该菌株产脂肪酶的发酵培养条件。最佳发酵培养基组成为:牛肉浸膏30g/l、橄榄油5.00g/l、聚乙烯醇-1240.125%、(NH4)2SO41.0g/l、MgSO47H2O1.0g/l、K2HPO41.0g/l、初始pH7.0。最佳的培养条件为:每20ml种子培养基中接入浓度为2.40×10~6个的孢子悬液,30°C、150r/min摇床培养24h。将2%(v/v)的液体种子接种于发酵培养基,32°C下,150r/min进行发酵培养48h。经发酵培养条件优化后,该菌产脂肪酶酶活从240.0U/mg提高到460.7U/mg,提高1.92倍。 通过硫酸铵分级盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析从发酵液中分离纯化脂肪酶,得到纯化倍数25.1,回收率16.5%,比活11552.2U/mg,分子量27kDa的纯品脂肪酶。 酶学性质研究结果表明,该脂肪酶的最适温度和pH分别为40°C,pH4.0;该酶在30-50°C和pH2.0-5.0范围内稳定。1mM K~+、Li~+、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)金属离子可以增强脂肪酶活力,而Fe~(2+)、Fe3+和Cu~(2+)对其抑制作用明显;该酶在10%(v/v)弱极性溶剂乙醚中稳定,丙三醇(20%,v/v)对该酶活性有增强作用,该酶对短链醇有较好的耐受性;该酶对餐饮废弃油脂具有良好的底物特异性;0.1%聚乙烯醇溶液可以作为表面活性剂提高酶活;经酶促动力学研究表明,该酶以橄榄油为底物时的Km和Vmax分别为0.11mM和0.41mM/min。该酶在经过热处理和冷复性之后,脂肪酶酶活得到增强。 本文获得Aspergillus oryzae CJLU-31脂肪酶为酸性脂肪酶,具有良好的温度稳定性和对餐饮废弃油脂的底物特异性,这为其在催化废弃餐饮油脂合成生物柴油的工业化生产提供了良好的应用前景。


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