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外来生物福寿螺热休克蛋白的克隆与其表达差异的研究

郑国湾  
【摘要】:福寿螺Pomacea canaliculata(Lamarck),是入侵我国及其他亚洲各国并对当地农业生产造成巨大损失的一种恶性外来生物。福寿螺适应性强,在新的环境中能很快建立新的种群,但其生存和分布受环境温度的影响,这些影响与福寿螺的生物学特性和生态学特征有关。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)作为一类在各种环境因子胁迫(如高温、压力、低温、缺氧等)下,生物体内迅速增强合成的高度保守的蛋白质,推测福寿螺对温度适应的差异及种群扩散与其体内的热休克蛋白有关。鉴于此,本论文以福寿螺作为研究对象,采用分子生物学、蛋白质组学和免疫组化等技术研究其体内四种主要热休克蛋白(HSP60、HSP70、HSC70和HSP90)的基因结构、组织特异性表达及温度胁迫对其表达的影响,分析福寿螺可能的温度适应机理,探讨福寿螺分布、扩散和危害机制,从而更好的在生产上防治该螺的危害。结果总结如下: 一、福寿螺HSP60、HSP70、HSC70和HSP90基因的克隆及序列分析 通过相近物种的HSP60、HSP70、HSC70和HSP90序列的同源性比对,设计出相应的基因特异性简并性引物;通过反转录PCR获得福寿螺HSP60、HSP70、HSC70和HSP90cDNA序列的部分片断。然后,利用RACE技术分别获得各基因的5’和3’端cDNA片段。最后,经过各片段的拼接,获得HSP60、HSP70、HSC70和HSP90cDNA全长序列。同源性比对分析发现,HSP60、HSP70、HSC70和HSP90分别与其他物种(尤其是其它软体动物)HSPs具有高度同源性。 福寿螺HSP60cDNA全长为2447bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为1722bp,编码574个氨基酸,预测的分子量约为61.07kDa,理论等电点为5.41。另外5’非翻译区(5’UTR)长41bp,684bp的3’UTR含有典型的加尾信号序列AATAAA和poly(A)尾巴。福寿螺HSP70cDNA全长为2281bp,ORF为1911bp,编码637个氨基酸,预测的分子量约为69.97kDa,理论等电点为5.53。5’UTR长90bp,280bp的3’UTR含有经典的多聚腺苷酸信号序列AATAAA和poly(A)尾巴。福寿螺HSC70cDNA全长为2275bp,ORF为1950bp,编码650个氨基酸,预测的分子量约为71.41kDa,理论等电点为5.43。另外包含77bp的5’UTR和248bp的3’UTR,其中3’UTR中有非典型的多聚腺苷酸信号序列ATTAAA和poly(A)尾巴。福寿螺HSP90cDNA全长为2546bp,ORF为2178bp,编码726个氨基酸,预测的分子量约为82.71kDa,理论等电点为4.70。5’UTR长86bp,282bp的3’UTR含有有经典的多聚腺苷酸信号序列AATAAA和poly(A)尾巴。 根据福寿螺HSP60、HSP70、HSC70和HSP90cDNA全长序列分别分段设计特异性引物,对福寿螺基因组序列进行扩增,获得HSP60、HSP70、HSC70和HSP90基因组序列全片段。除了福寿螺HSP70基因不含内含子结构外,HSP60基因含有13个内含子,HSC70含有9个内含子,HSP90含有8个内含子,其中在5’UTR均存在一个内含子。在大多数内含子中,都存在类似具有转录激活作用的顺式作用元件,如HSE(Heat shock element)、TATAbox和CAAT box等,推测这些内含子的存在对福寿螺HSPs表达的调节具有重要的意义。 二、福寿螺热休克蛋白的表达特征 (1)采用实时荧光定量PCR检测经不同温度处理后福寿螺鳃、消化腺、肾和足部肌肉HSP60、HSP70和HSP90的转录水平。结果表明实验室驯养条件(26±1°C,对照)下福寿螺HSP60、HSP70和HSP90的转录表现为组织特异性,三个基因的转录水平差异较大,其转录水平为HSP90HSP60HSP70;在热激和冷激中,福寿螺各组织HSP60的转录水平各组织上调均不显著,其中肾和足部肌肉组织在(9°C、12°C、30°C和33°C)发生下调;高温处理诱导HSP70和HSP90的转录,各组织中HSP70和HSP90热激(36°C和39°C)后与冷激(9°C后和6°C)后和对照相比,均显著升高。福寿螺HSP70属于热诱导性表达,实验室驯养情况下处于较低的本底水平,当受到热激(36°C和39°C)后,其转录水平急速上调,上调比例可达1000倍以上。这些结果表明,在福寿螺的温度适应过程中,HSP70和HSP90起到关键的作用,也一定程度的说明福寿螺能耐高温,对低温敏感的原因。 (3)采用荧光实时定量PCR和Western blot检测了福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉组织在高温(36°C)、低温(9°C)及在实验室驯养情况下的HSC70转录和表达情况。Q-PCR结果表明,福寿螺HSC70为组成型表达,表现出组织特异性。在36°C热激后,各组织HSC70转录水平均发生明显上调;而在9°C冷激后,其转录水平均未发生显著变化。通过热激和冷激的比较,福寿螺HSC70更倾向于热激诱导。这说明了HSC70在福寿螺的高温适应过程中起着重要的作用。免疫印迹结果显示福寿螺各个组织均有HSC70蛋白的表达,包括成年和幼年福寿螺,蛋白表达也表现为组织特异性,说明福寿螺HSC70在福寿螺的生长发育及各组织细胞生长分化中扮演着重要角色。此外,通过间接免疫荧光技术对HSC70蛋白在鳃组织中进行了定位,结果显示福寿螺HSC70蛋白大量分布与鳃瓣细胞中,与鳃组织生理功能密切相关。


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