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实时可视化PMA-LAMP方法检测三种食源性微生物活菌方法研究

吴莹莹  
【摘要】:当今社会,由食源性致病菌引起的食物中毒情况依旧十分严峻,对全世界尤其是发展中国家的食品卫生安全造成巨大的威胁。在世界范围内,沙门氏菌和副溶血性弧菌是最为常见的两种引起食物中毒的致病菌,而霍乱弧菌则时常引起霍乱的暴发流行,严重威胁着人们的生命财产安全。因此,建立相应的快速检测手段至关重要。目前,各类免疫、分子相关的快速检测技术逐渐趋于完善和成熟,但它们普遍存在需要专业人员、价格昂贵等缺点,并且不能区分食品中存在的活菌与死菌,这势必加大检测结果假阳性的可能性,造成不必要的恐慌和资源浪费。针对上述难题,本论文建立可视化PMA-LAMP快速检测技术来检测这三种食源性致病菌活菌,一方面解决LAMP技术存在的两个方法学基础问题,一方面为食品安全的诊断防治提供新思路和技术平支持。本研究根据霍乱弧菌thy A基因(Gen Bank登录号:AY143429.1)、副溶血性弧菌tox R基因(Gen Bank登录号:GQ228073.1)、沙门氏菌inv A基因(Gen Bank登录号:M90846.1)、沙门氏菌fim Y基因(Gen Bank登录号:JQ665438.1)的相关序列,分别设计LAMP和荧光定量PCR引物,并构建标准质粒。经过优化,确定可视化LAMP反应的体系如下:20 m M Tris-HCl(p H 8.8),10 m M KCl,8 m M Mg SO4,10 m M(NH4)2SO4,0.1%Tween 20,0.8 M甜菜碱(Betaine),d NTPs各1.4 m M,0.4μM F3/B3,3.2μM FIP/BIP,1.6μM LF/LB,0.3 M钙黄绿素(Calcein),0.5 M Mn Cl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μL DNA模板。由于钙黄绿素的荧光特性和SYBR Green I相近,因此反应结果分别可以从荧光曲线和颜色变化两个方面进行鉴定,前者是实时半定量分析,后者是肉眼直接观察的定性分析。特异性试验和灵敏度试验结果显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的LAMP引物特异性良好,检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×101CFU/m L、6.3×102-6.3×103 CFU/m L。q PCR结果和LAMP结果一致。对于PMA的处理条件,确定暗室孵育时间为5 min,LED灯曝光时间为30min,然后对霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的PMA处理浓度及待处理的最高死菌浓度进行优化,得到PMA浓度分别为15μM、20μM和5μM,并且,PMA能高效处理最多105 CFU/m L浓度的死菌。将优化好的PMA处理步骤结合可视化LAMP,建立可视化PMA-LAMP,并与PMA-q PCR进行对照。在灵敏度试验中,将梯度稀释的活菌分别添加到105 CFU/m L的死菌基质中,制成死活菌混合液,所得霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP检出限分别为1.1×102 CFU/m L、5.0×102 CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,与PMA-q PCR结果吻合;在模拟食样试验中,按照上述死活菌混合液制备方法制备菌液,然后人工污染干净的鳕鱼或鸡蛋样品。数据显示,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌可视化PMA-LAMP检出限则依次为1.7×102 CFU/m L、1.9×102CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,结果与PMA-q PCR一致。在实际样品检测中,从市场上随机购得海产品、蛋类、蔬菜等新鲜样品,经过适当时间的前增菌步骤后,分用可视化PMA-LAMP方法、PMA-q PCR方法和行业标准或国家标准提供的检测方法进行检测,结果显示,霍乱弧菌的检出率依次为2.5%、2.5%和0%,副溶血性弧菌的检出率依次为23.6%、20.8%和20.8%,沙门氏菌的检出率依次为0%、0%和0%。由此可见,可视化PMA-LAMP方法检测时间短,加上至少6h的前增菌,最快只需要8 h不到的时间,且在仪器条件缺乏的情况下,可采取定性分析的方法来进行初筛,提高后续鉴定的效率。本研究将可视化LAMP技术与PMA染料结合,建立霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的可视化PMA-LAMP快速检测方法,不仅保留可视化LAMP快速简便、高特异性、高灵敏度、适合现场操作等优势,兼顾PMA染料低毒性和高特异性抑制死菌扩增等特点,并且对LAMP方法的荧光半定量检测做了一系列初探工作,在配备荧光定量PCR仪的条件允许下,可无需依赖新的仪器设备,对待测样品进行实时分析。该方法为检测食品中的活的致病微生物搭建了新的技术平台,为尤其是偏远落后地区的食品卫生安全提供新的检测思路。


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