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维吉尼亚链霉菌IBL14中氧甲基转移酶基因的鉴定和功能分析

韩毛振  
【摘要】:维吉尼亚链霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)为本实验室筛选出的有效的转化和降解甾醇类化合物茼株。前述研究证明IBL14菌株通过氧甲基转移酶使薯蓣皂素B环上发生甲氧基化形成6-甲氧基产物这一首次发现的甾体化合物的生物甲氧基化。 本研究对IBL14菌株的全基因组进行测序,使用BLASTP工具分析测序结果,在IBL148.0Mb的线性染色体中筛选出9个氧甲基转移酶(OMTs, EC2.1.1.X)。使用软件分析,结果表明IBL14中9个氧甲基转移酶分别属于不同的甲基转移酶家族:SviOMTO1, SviOMT05和SviOMT08属于methyltransf_2superfamily; SviOMT02, SviOMT03, SviOMT04, SviOMT06和SviOMT07属于amdomet-MTases superfamily; SviOMT09属于亮氨酸羧甲基转移酶超家族(LCM superfamily)。在进化关系方而,IBL14与Streptomyces sp. C和Streptomyces sp. Mgl具有较近的亲缘关系;进一步分析表明SviOMT03和SviOMT06与链霉菌属中的caffeoylCoA-O-methyltransferase (CCOMT)的亲缘关系较近,推测可能具有相近的功能。 本研究将IBL14中9个氧甲基转移酶基因全部克隆到大肠杆菌中,验证并成功诱导表达了目的蛋白。使用HPLC及LC/MS检测投料后菌体的代谢产物证明蛋白SviOMT03能够甲基化咖啡酸成阿魏酸,SviOMT06可以甲基化咖啡酸/3,4-二羟基苯甲酸成阿魏酸/4-羟基-3甲氧基苯甲酸。 使用蛋白质同源建模技术和分子对接对蛋白质和小分子底物的相互作用进行分析,发现蛋白质SviOMT03和SviOMT06有两个口袋(pockets),即两个活性位点,容纳SAM的腺苷部分和甲硫氨酸的侧链。其氧甲基化过程中极性氨基酸Lys143, Glu38(SviOMT03)/Ser44(SviOMT06), Ser74, Asp140, Tyr149和底物之间可以形成氢键结合,预测为反应的关键氨基酸残基。进一步的研究分析推测其反应机制SN2反应机制,其两个活性位点分别接纳SAM和底物咖啡酸,底物咖啡酸的3-羟基核被转移到His142(SviOMT03)和His171(SviOMT06)的N原子上,苯酚离子(强亲核试剂)直接从带正电荷状态的SAM中转移甲基到His142或Hisl71的N原子上形成产物阿魏酸。选取蛋白质中74位的Ser作为突变的靶点,将其突变成Ala,突变之后的蛋白质失去咖啡酸转化成为阿魏酸的活性。


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