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鲍曼不动杆菌耐药持留菌的形成机制研究

马亚男  
【摘要】:鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanmii)是一种重要的院内感染致病菌,能够引发呼吸道感染、泌尿系统感染等。鲍曼不动杆菌耐药问题一直是临床感染治疗的最大障碍。持留菌的存在可能是其临床治疗失败和感染复发的真正原因,同时也是导致耐药率不断上升的原因之一。近些年持留菌引起的耐药问题受到广泛重视,鲍曼不动杆菌持留菌的基本特征及形成机制的研究对于更好的控制持留菌引起的耐药及感染问题具有重要的指导意义,也为其他物种中持留菌的研究提供理论依据。本研究以鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606为研究对象,开展鲍曼不动杆菌耐药持留菌的基本特征及其形成机制的研究。首先检测了鲍曼不动杆菌的生长曲线和抗生素抗性谱。生长曲线测定结果帮助确定鲍曼不动杆菌的对数期与平台期的培养时间。抗性谱的测定结果与美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的标准比较发现鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606抗生素的抗性水平较低:对多数(9/13)抗生素敏感,仅对氨苄西林(AMP)和头孢吡肟(CPM)耐药。这些结果为后续实验时间点的选取和抗生素的选择提供了实验依据。为了了解持留菌形成特点及规律,本研究首先优化了分离及定量鲍曼不动杆菌的持留菌细胞的方法,比较了不同的生理状态下以及不同的抗生素压力条件下鲍曼不动杆菌持留菌水平的差异情况。实验结果表明鲍曼不动杆菌在持留菌的形成过程中具有与其他细菌类似的二相型死亡曲线,即大量敏感细菌快速裂解死亡,而持留菌的量维持相对稳定。平台期的细菌菌群中含有的持留菌比例要显著高于对数生长期,说明鲍曼不动杆菌的持留菌水平与菌株的生理状态密切相关。此外,持留菌的形成呈现出十分明显的抗生素种类和浓度依赖性,不同的抗生素的死亡曲线的情况大不相同,其中多粘菌素B(PB)与高浓度的妥布霉素(TOB)具有消除持留菌细胞的能力。以上这些结果让我们对鲍曼不动杆菌持留菌的基本特征有了进一步的认识。借助生物信息学工具对721株已测序的鲍曼不动杆菌基因组中可能的II型毒素-抗毒素系统(TA系统)进行了彻底的搜索,结果表明鲍曼不动杆菌持留菌的中II型TA系统十分多样,包含至少15对的TA系统。我们挑选其中报道有功能的5对TA系统,分别为RelB/RelE、HicA/HicB、GP49/Cro(HigB/HigA)、 HTH/GNAT及DUF497/COG3514系统,在44株临床多耐药鲍曼不动杆菌菌株中的分布情况做了进一步分析。结果表明,HTH/GNAT、GP49/Cro(HigB/HigA) 与DUF497/COG3514的分布十分广泛广泛,分别占总菌株的61%、56%和40%。另一方面, real-time PCR的方法对持留菌与非持留菌中II型TA系统的表达量进行了确认,结果表明持留菌中3类II型TA系统(GP49/Cro (HigB/HigA)、 HTH/GNAT及DUF497/COG3514)的表达量要显著高于非持留菌。以上结果表明3类Ⅱ型TA系统在持留菌形成过程中扮演重要角色。为了更为全面的了解持留菌形成及恢复生长过程中起主要调控作用的基因和通路情况,深入的认识持留菌发生及转化的调控机制,我们借助Miseq高通量测序平台在转录组水平上对持留菌形成及恢复生长的整个过程中差异表达的基因和基因所富集到的通路进行了分析。结果表明在加入抗生素的第一个小时和重新培养的第5小时差异表达的基因数目最多,上调和下调2倍的基因数目分别是898个、566个和704个、964个。差异表达的基因所富集的通路分析结果表明碳水化合物代谢途径和能量代谢途径在持留菌形成和恢复生长过程中均有表达,而异源物质的生物降解途径在持留菌形成阶段特异存在,推测异源物质降解相关基因在持留菌形成过程中扮演了重要角色。聚类分析找到了一些在持留菌时期表达量升高而在持留菌恢复生长时下降的基因,另外对4类TA系统的表达情况的结果表明GP49(HigB)/Cro(HigA)、DUF1044/RelB这两对TA系统在持留菌的潜伏期(E1-E3)显著升高。这些基因可能在持留菌形成过程中发挥了重要作用。总之,鲍曼不动杆菌持留菌的形成机制是极为复杂的,后续我们将进一步缩小这一范围并开发有效的控制持留菌感染的新方法。


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