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α-淀粉酶AmyP融合三个外源淀粉结合结构(SBD)后的酶学性质研究

张销寒  
【摘要】:α-淀粉酶(α-amylase)是一个重要的工业用酶,广泛应用在食品、化工、酿造等行业。具有生淀粉降解能力的α-淀粉酶AmyP来自海洋宏基因文库,它不仅能快速的降解多种生淀粉,而且对生大米淀粉具有偏好性。AmyP有一个淀粉结合结构域SBD,该SBD的缺失不会急剧降低AmyP的生淀粉降解能力。为了提高AmyP的降解能力,我们对 AmyP 的 SBD 进行了替换,选择来自 Cryptococcus sp.S-2,Thermobifidafusca NTU22和Clostrid u butyricum T--7 的α淀粉酶酶的SBBD 与 AyPP△BBD(缺失SBD)进行融合,在大肠杆菌中重组表达,获得三个融合酶AmyP-Cr、AmyP-Th和AmyP-Cl。融合酶AmyP-Cr是AmyP△SBD与Cryptococcussp.S-2的α-淀粉酶的SBD的融合,在三个融合酶中酶学性质最好。AmyP-Cr对生大米淀粉的比活达到327.9±31.8 U/mg;是野生型AmyP的1.7倍。4h内,AmyP-Cr对大米生淀粉的最高降解率为46.6%,是野生型AmyP的1.8倍。AmyP-Cr的对生大米淀粉的最高结合率为0.113 uM/g,是同条件下AmyP的5.1倍。而且AmyP-Cr的热稳定性也获得了提高,40°℃的半衰期超过12 h,是野生型AmyP的5.1倍。这些数据表明融合酶AmyP-Cr对生大米淀粉降解能力的提高,是由于来自Crpytococcussp.S-2的SBD能同时提高酶对生大米底物的吸附力和热稳定性。AmyP-Cr是一个新的性质比较优良的生大米淀粉降解酶。融合酶 AmyP-Th 是 AmyP△SBD与Thermobifda fusca NTU22 的α-淀粉酶的 SBD 融合。AmyP-Th对生大米淀粉的比活为254.2±26.5 U/mg,为野生型AmyP的1.3倍。4h内,AmyP-Th对大米生淀粉的最高降解率为39.6%,虽然比野生型AmyP的提高了1.5倍,但是略低于AmyP-Cr的降解率。AmyP-Th的热稳定性没有明显改善。融合酶 AmyP-C l是 AmyPASBD 与 Clostridium butyricum T-7 的 α-淀粉酶的 SBD 融合。AmyP-Cl对生大米淀粉的比活为468.6±43.5 U/mg,为野生型AmyP的2.4倍。虽然AmyP-Cl的比活在三个融合蛋白中最高,但是AmyP-Cl在4h内对大米生淀粉的最高降解率为41.6%,略低于AmyP-Cr。此外,AmyP-Cl的热稳定性也没有明显改善。


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