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多功能天然高分子纳米药物输送体系的构建及抗肿瘤研究

韦兵  
【摘要】:近年来,随着材料科学和纳米技术的发展,纳米药物输送体系的研究不断深入,目前已成为肿瘤治疗的研究热点。与传统小分子化疗药物相比,纳米药物载体能显著提高负载药物的肿瘤传输效率并降低药物的副作用。纳米药物载体之所以能够向肿瘤和正常组织差异性的输送治疗药物,是基于其对肿瘤组织的高渗透性和滞留效应(EPReffect)。由于肿瘤周围血管异常和淋巴回流缺失,纳米药物载体可穿透肿瘤组织并在特定部位释放药物,从而减少对正常组织的损伤,减少副作用。然而,纳米药物载体在肿瘤中的传输过程主要包括血管传输,跨血管传输和肿瘤间质传输三个主要步骤,而由于肿瘤生理的异常,如致密的细胞外基质(ECM)、淋巴系统的缺失引起升高的间隙压力等,每一个传输过程都是纳米药物载体向肿瘤实质渗透时需要克服的屏障。通过EPR效应被动富集在肿瘤的纳米载体,虽然可以从血管中渗出,但不能有效的穿过ECM,只能在血管周围不均匀堆积,无法有效的被癌细胞摄取,大大降低了抗肿瘤效果。另外由于EPR效应受肿瘤位置,巨噬细胞浸润量,孔径大小等因素的影响,被动靶向仅限于某些类型的肿瘤,而且EPR效应仅限于一些直径大于约4.6 mm的实体瘤。为了克服这些缺点,本论文通过在纳米载体表面共价修饰肿瘤靶向配体(苯硼酸、乳糖酸)及可以降解ECM的蛋白酶(菠萝蛋白酶),构成多功能纳米载体,有望克服单功能纳米药物载体在肿瘤中的渗透障碍,增强药物的肿瘤富集、渗透和细胞摄取,从而提高抗肿瘤效果。此外,由于天然高分子材料不仅来源广泛,价格便宜,易修饰,能够大批量的分离和提纯,以及良好的生物相容性和生物可降解性,安全无毒等优点。因此,本论文选择以天然高分子为基材设计制备了一系列纳米药物传递系统。总之,本论文设计的多功能纳米粒子具有设计简单、结构与功能精确可控以及生物可降解等优点,对纳米载体在抗肿瘤治疗领域的应用和新型纳米载药体系的发展意义重大。研究内容主要分如下三个部分:(1)以生物相容性良好的明胶(Type B)为起始材料,通过去溶剂法成功制备了明胶纳米粒子(NP1)。将肿瘤靶向配体3-羧基苯硼酸(3-CPBA)通过共价作用修饰在NP1表面构建了具有肿瘤靶向功能的纳米粒子(NP2)。通过透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)和动态光散射(DLS)研究了 NP1和NP2的形貌结构和稳定性。结果表明,NP1和NP2均呈球形结构,并在各种条件下具有较好的动力学稳定性。选择阿霉素(DOX)作为抗肿瘤药物模型并将其负载到NP1和NP2分别得到载药纳米粒子NP1-DOX和NP2-DOX,在不同pH值下考察了载药纳米粒子的药物释放行为,发现随着pH从7.4下降到5.0,纳米粒子的阿霉素释放速率显著增加。分别利用平面细胞模型(SH-SY5Y细胞、H22细胞和HepG2细胞)和三维(3D)培养的多细胞球体(SH-SY5YMCS)通过激光共聚焦显微镜(CLSM)、流式细胞仪(FCM)和MTT法等系统研究了 NP1-DOX和NP2-DOX的体外细胞摄取及细胞毒性。最后,通过H22荷瘤小鼠模型利用近红外活体成像仪、肿瘤组织病理学分析、抗肿瘤实验等方法研究了两种载药纳米粒子的肿瘤富集、渗透及抑制能力。所有结果表明,通过3-CPBA的修饰,可以显著提高纳米粒子的肿瘤识别能力,从而提高其在肿瘤部位的富集和抗肿瘤效果。(2)以水溶性和生物相容性优良的羧甲基壳聚糖(CMCS)为起始材料,通过去溶剂法制备了羧甲基壳聚糖纳米粒子(CM NPs)。选择3-羧基苯硼酸(3-CPBA)作为肿瘤靶向配体,将其修饰到CMNPs表面得到具有肿瘤靶向功能的纳米粒子(CB NPs)。利用动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对两种纳米粒子的粒径大小、形貌结构和稳定性进行表征。结果表明,CMNPs和CBNPs均显示接近球形结构,大小均一,且在各种条件下具有较好的动力学稳定性。阿霉素(DOX)作为模型药物成功包载于纳米粒子得到载药纳米粒子CM-DOX和CB-DOX NPs。通过单层细胞模型和三维多细胞球体(MCS)研究了这些载药纳米粒子的生物学效应。结果表明3-CPBA的修饰可以提高纳米粒子的肿瘤富集和渗透能力。利用H22肿瘤肺转移小鼠模型评价了这些载药纳米粒子的体内抗肿瘤效果。结果表明,与CM-DOXNPs相比,CB-DOX NPs具有较好的肿瘤富集和滞留能力,从而显著减小了 H22肿瘤肺转移小鼠的肿瘤大小。所有结果证明,CBNPs作为一种新型纳米药物载体,在肿瘤靶向给药方面具有很大的潜力。(3)肿瘤细胞外基质(ECM)是阻碍药物在肿瘤组织中扩散的主要障碍。针对此问题,选择良好生物相容性的壳聚糖作为起始材料,首先利用乳糖酸与肿瘤细胞表面过表达受体(脱唾液酸糖蛋白)的特异性识别作用,将肿瘤靶向配体乳糖酸修饰到壳聚糖表面得到肿瘤靶向的聚合物(CLA),通过去溶剂法成功制备了 CLANPs。随后通过共价作用将菠萝蛋白酶修饰在CLANPs表面得到CLAB NPs,提高其穿透ECM到达肿瘤细胞的能力。利用动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)测定和观察了这些纳米粒子的粒径大小、形貌结构以及在不同条件下的稳定性。将阿霉素(DOX)作为模型药物成功包载于CLA和CLABNPs,并在三种不同pH(7.4,6.5和5.5)下考察了其药物释放曲线。酶活性实验证明,修饰到纳米粒子表面的菠萝蛋白酶仍保持其酶活性。利用HepG2和SH-SY5Y细胞进行了细胞摄取和细胞毒性实验,结果表明,与游离DOX相比,乳糖酸修饰的肿瘤靶向纳米粒子显示出对肝癌细胞的高选择性以诱导有效的细胞毒性作用。体外三维(3-D)培养的多细胞球体(SH-SY5Y和 HepG2MCS)实验表明 CLAB-DOXNPs显著提高了 DOX 在 MCS中的渗透。体内药物分布和抗肿瘤活性结果表明,乳糖酸和菠萝蛋白酶双功能化的纳米粒子,由于其具有主动靶向功能和降解ECM能力,因此可以递送更多的药物到达肿瘤组织,具有较好的肿瘤抑制能力。


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