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新型真菌漆酶基因的克隆及其表达调控的分子机制

洪宇植  
【摘要】:将漆酶保守序列引物扩增法与长距离反向PCR(LD-IPCR)技术相结合,建立了真菌漆酶基因的新型克隆体系,从栓菌AH28-2(Trametes sp.AH28-2)中克隆得到三个漆酶同工酶基因(lacA、lacB和lacC)和一个漆酶假基因lcD。这些同工酶基因与其它担子菌漆酶在氨基酸水平上呈现出很高的相似性。lacA、lacB和lacC的5′-非编码区均存在多个可能的顺式作用元件一致序列,包括TATA box、CAAT box、MRE、XRE和CreA结合位点,这三个基因5′-非编码区的平均G+C含量分别为59%、60%和52%。lacA和lacB的TATAbox位于起始密码子上游约-100bp处,与其不同,lacC的TATA box位于-172bp。Cu~(2+)的存在对于Trametes sp.AH28-2漆酶同工酶基因的表达是必需的,并且Cu~(2+)浓度的不同对同工酶的诱导效应不同,低浓度的Cu~(2+)(0.5mmol/L)能够诱导产生LacA和一新型漆酶,而高浓度的Cu~(2+)(1-2mmol/L)只诱导合成LacA。侧链基团不同的芳香化合物能够诱导特定漆酶同工酶的表达,邻甲苯胺诱导产生单一的漆酶组分(LacA),而3,5-二羟基甲苯主要诱导产生同工酶LacB。由3,5-二羟基甲苯诱导,在培养后期LacA与LacB的比率下降。葡萄糖对于Trametes sp.AH28-2漆酶的表达具有抑制效应,以纤维二糖代替葡萄糖引起发酵液漆酶活力急剧增长。定量RT-PCR结果表明,漆酶mRNA转录本的累积伴随着发酵液中相应漆酶活力的增加。 将漆酶同工酶lacA的cDNA克隆到pPIC9K载体上,以α-因子前导序列为分泌信号,在Pichiapastoris GS115细胞中进行异源活性表达。在含有0.3mmol/LCu~(2+)、0.2%(w/v)丙氨酸的BMM培养基(pH6.0)中,20℃条件下最有利于重组漆酶的合成,最适甲醇添加量为0.5%(v/v),摇瓶发酵获得的最高漆酶产量为4.0mg/L(1360U/mg)。重组漆酶LacA对底物ABTS的表观Km为24.6μmol/L,与天然LacA的Km(25.0μmol/L)基本相近,两种漆酶的含糖量(8.5%)相同。然而,与天然酶相比,重组LacA与底物ABTS或愈创木酚反应的最适pH有向酸性漂移的趋势。重组LacA与天然LacA的最适稳定pH分别为5.5和8.5,并且,


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