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~(60)Co-γ射线对糖多孢红霉菌的重复诱变研究

武杉杉  
【摘要】: 随着抗生素耐药性问题日益严重,迫切需要寻找新型抗菌药物。酮内酯类抗生素在对付耐药菌方面作用突出,是最有希望的新型抗菌药物。利用同源重组方已构建了糖多孢红霉菌M,可以合成一种新酮内酯类化合物--3-脱氧-3-羰基-红霉内酯B,然而产量较低,产物没有抑菌活性。通过60Co-Y射线对糖多孢红霉菌M进行诱变,选育出的糖多孢红霉菌963和967虽然产物具有抑菌活性,但产量有待进一步提高。 通常复合诱变具有较好的诱变效果。本实验选用60Co-γ射线对分别糖多孢红霉菌963和967进行重复诱变选育,以期获得高产突变株。在对孢子稀释液的选择上,分别用生理盐水和5%、10%、20%、40%和80%甘油适当稀释孢子,以不同剂量辐照处理(不辐照的样品为空白对照),涂平板,计数并计算孢子致死率,选择适宜的孢子稀释液和适宜的辐照剂量;采用适宜的条件对孢子进行重复诱变处理,并结合一定浓度的链霉素R3M抗性平板筛选突变株。观察菌株形态,取诱变株发酵液做枯草杆菌抑菌试验,筛选正突变,计算突变率,并研究60Co-γ射线对糖多孢红霉菌963和967的重复诱变效应。为了初步探讨链霉素抗性筛选方法,以糖多孢红霉菌963为研究对象,同时采用在R3M平板中逐渐提高链霉素浓度的方法对诱变株进行筛选。 测定链霉素最低抑制浓度的实验表明,随着链霉素浓度的增加,其对糖多孢红霉菌963和967的抑制作用增强。当链霉素浓度分别达到140μg/mL和120μ,g/mL时,平板上无可再生菌株,为最小致死浓度。在固定链霉素浓度抗性筛选法实验中,选用130μg/mL和110μg/mL链霉素抗性平板对诱变株进行筛选;在增加链霉素浓度抗性筛选法实验中,以糖多孢红霉菌963作为研究对象,将浓度由130μg/mL逐渐增加到140μg/mL、150μg/mL和160μg/mL。 通过比较生理盐水和5%、10%、20%、40%和80%甘油对辐照孢子生长的影响以及实验的可操作性,发现生理盐水作孢子稀释液为宜。实验表明,辐照剂量越高,孢子致死率越高。当剂量为500Gy时,糖多孢红霉菌963和967的孢子致死率均为90%左右,选择为最佳诱变剂量。 利用60Co-γ对糖多孢红霉菌963的重复诱变选育时,获得了一株正突变株,其抑菌活性明显增强,遗传稳定,正突变率达2.01%o;有12株形态变异株,其产孢时间、孢子颜色等均发生较大变化,形态变异率为24.1%o。与单次诱变相比,重复诱变获得了较好效果。 增加链霉素抗性选择压筛选实验结果显示,与固定选择压相比,虽然形态变异有了显著提高,但是产生过高的负突变率不利于有效筛选。 采用60Co-γ射线辅以固定链霉素抗性选择压的方法筛选糖多孢红霉菌高产突变株,可以显著提高菌株形态变异和正突变率。得到的突变株遗传稳定性良好,克服了诱变随机筛选的不定向性和盲目性,提高了育种的工作效率。本实验结果为糖多孢红霉菌工业化应用的进一步研究奠定了基础。


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