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发光功能化纳米材料在结核病诊断化学发光核酸传感器中的应用

蒋杰  
【摘要】:论文首先综述了化学发光、纳米材料参与的液相化学发光体系、化学发光核酸传感器、发光功能化纳米材料及其在化学发光核酸传感器中的应用和结核病诊断方法的研究现状。化学发光分析由于灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、价格便宜等优点,已经成为生物分析包括免疫分析与核酸分析的主要探测手段。目前发光生物分析方法主要依赖于标记技术,各种标记物与蛋白分子或核酸片段偶联形成生物分析探针,因此,制备特异、灵敏的分析探针是这一技术成功的关键。现行的商业上基于标记技术的化学发光生物分析方法中,一个分析探针仅能联接单个信号分子,使分析的灵敏度受到限制,难以进行低含量组分的检测。因此,一个分析探针联接多个信号分子的多标记分析方法受到了人们的关注。通过在纳米材料上富集多个化学发光信号分子即发展发光功能化的纳米材料,成为一种具有创新概念的纳米科学发展新趋势。这些发光功能化纳米材料为核酸分析探针提供了一种理想的具有信号放大功能的标记物,有望对传感器的灵敏度的提高起到积极地推动作用。基于此,本论文围绕着发光功能化纳米材料在结核病诊断化学发光核酸传感器中的应用这一研究主题,开展了一系列研究工作。利用实验室前期工作合成的鲁米诺发光功能化纳米金构建核酸分析探针,发展了均相和异相两种分析策略,开发出两种化学发光核酸传感器,并进一步推向于实际应用,实现对结核病临床快速灵敏特异诊断。此外,我们探索新型简单快捷的合成方法,制备了具有高量子产率的新型发光纳米材料——碳点,研究了所制得碳点的形貌、表面化学组成和荧光性质等;设计与构建碳点参与的化学发光新体系,探索了其化学发光行为、规律和机理。主要研究内容如下: 1.基于鲁米诺发光功能化纳米金卓越的信号放大功能,标记DNA构建信号探针,同时引入纳米金修饰电极以及生物素-链霉亲和素生物放大系统,构成多重信号放大基元,由此发展了一种新型的超灵敏电致化学发光DNA传感器,用于结核分枝杆菌(TB)的检测。传感器的构建过程如下:我们选取结核分枝杆菌特异性插入序列IS6110中一段DNA片段作为靶基因序列,设计与合成了能与之发生特异性互补杂交的两段探针。将捕获探针固载到链霉亲和素包裹的纳米金修饰电极上,与TB目标链反应后,鲁米诺发光功能化纳米金标记的信号探针随即组装连接到修饰电极的表面,形成“三明治”模式的TB传感器。富集在鲁米诺发光功能化纳米金表面的鲁米诺发光分子作为信号源,在双阶脉冲电压下会产生电致化学发光信号响应,从而实现对TB目标链的检测。所构建的电致化学发光TB传感器对于人工合成的TB目标链的检测限可达到6.7×10-15mol/L,该检测限优于文献报道的其它基于金纳米探针的结核分枝杆菌基因诊断方法。该TB传感器稳定性好且具有良好的选择性,其它致病菌如大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA对于目标物的测定几乎不产生影响。此外,该TB传感器成功被用于结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取的基因组DNA的检测,对于结核分枝杆菌实际临床基因诊断具有重要的应用潜力。 2.采用鲁米诺发光功能化纳米金标记适配体构建了发光功能化纳米适配体探针,利用适配体探针识别目标物所引起的氯化血红素/G-四联体DNA酶构型的转变,以及氯化血红素/G-四联体DNA酶对鲁米诺功能化纳米金的化学发光增强作用,提出了均相分析策略,发展出一种用于结核病诊断相关的干扰素.-gamma检测的化学发光适配体传感器。传感器的构建过程如下:我们将氯化血红素/G-四联体DNA酶中的G-四联体链对称地劈裂成两部分,并将这两部分连接到干扰素-gamma适配体(记作P1链)的互补序列的两端从而形成P2链。端基生物素化的P1链与P2链杂交形成稳定的双链结构,同时,通过生物素-链霉亲和素之间的特异性相互作用组装到链霉亲和素包裹的鲁米诺发光功能化纳米金上,从而成功构建了鲁米诺发光功能化纳米金传感平台。与鲁米诺发光功能化纳米金传感平台中的干扰素-gamma适配体识别目标物干扰素-gamma时,释放P2链到溶液中。处于自由状态的P2链可以自组装形成稳定的G-四联体结构,并与随后加入的氯化血红素反应形成氯化血红素/G-四联体DNA酶,有效催化鲁米诺发光功能化的纳米金与过氧化氢之间的化学发光反应,从而实现对干扰素-gamma特异性的定量检测。所构建的适配体传感器用于检测目标干扰素-gamma时,展现出较宽的线性范围0.5~100nmol/L和低的检测限0.4nmol/L。这一检测限与之前文献报道的多数异相的干扰素-gamma检测适配体传感器的检测限基本相当,但更为简便、快速和实用。此外,该适配体传感器显示出良好的精确度、稳定性和重现性,不被复杂的人血清基质所影响,在生理介质中显现出的较强的适用性,在结核病临床诊断中具有重要的实际应用潜力。 3.报道了一种简单便捷的碳点合成方法,通过使用氨基酸作为前驱体,经由酸/碱辅助的一步微波法制备碳点。借助高分辨透射电子显微镜(HRTEM)、X射线粉末衍射(XRD)、X射线光电子能谱(XPS)、紫外-可见吸收光谱(Uv-vis)、傅里叶红外光谱(FT-IR)和荧光光谱等仪器分析手段,对所合成的碳点的形貌结构、表面状态和光学性质进行了详细研究。结果表明,所合成的碳点大小均一,粒径在1-4nm之间。表现出强烈的荧光性质和优良上转换发光特性,量子产率高于目前文献报道的绝大多数碳点,是目前量子产率最高的碳点之一。此外,该碳点还能够有效增强高碘酸钠-过氧化氢体系的超微弱化学发光。本章工作所作研究与所获结果为碳点光学性质的研究提供了新视点,并且对于拓宽碳点这种新材料在分析领域的应用具有一定的重要意义,在光电器件、生化分析、生物医学和生物成像等领域有重要的应用前景。


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